重组stnfr1蛋白包涵体洗涤方法的研究-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（９）：４５５２ 重组ｓＴＮＦＲ１蛋白包涵体洗涤方法的研究 １ ２ ２ 罗　莉 　秦娇荣 　王明蓉 （１四川抗菌素工业研究所　成都　６１００５２　２成都生物制品研究所有限责任公司　成都　６１００２３） 摘要　目的：包涵体在变复性前通常需要用洗涤液多次重复洗涤以除去杂质，这种洗涤方式往往 造成包涵体收率低或洗涤时间长或纯度不高，直接影响到重组蛋白产品最终的产量和质量。通 过对ｓＴＮＦＲ１包涵体的洗涤条件进行优化，以期指导该品种的工业化生产。方法：首先采用由脱 氧胆酸钠和尿素组成的两因素五水平的析因设计，以洗涤后目的蛋白的含量为评价指标，进行方 差分析，选出最优组合；通过对方差结果的分析提出不同于重复洗涤的分步洗涤方式，选出较优 的分步洗涤方式；然后放大洗涤样品量，验证重复洗涤和分步洗涤的结果；另外，针对不同发酵批 次和产量的样品，进一步验证比较重复洗涤和分步洗涤的效果。结果：重复洗涤的方差结果表明 单独使用脱氧胆酸钠或尿素洗涤的产量优于两者的联合使用，但其纯度低于两者的联合使用，其 中１ｍｏｌ／Ｌ尿素洗涤３次（Ｗ３组合）获得的目的产量最高；分步洗涤中２％脱氧胆酸钠洗涤第一 次，２％脱氧胆酸钠＋２ｍｏｌ／Ｌ尿素洗涤第二次的洗涤方式（ＦＷ６组合）既能有效提高目的蛋白纯 度，又节约了时间，是较优的组合方式；同一发酵水平（约２０％目的产量）不同规模样品（３ｇ和 ５０ｇ）分别经过Ｗ３和ＦＷ６洗涤后，蛋白纯度提高到约２６％和３１％，且后者的目的收率高于前者， 表明分步洗涤优于重复洗涤；针对不同发酵水平的样品（约１０％和６０％目的产量），分步洗涤的 效果也优于重复洗涤，但对于低发酵水平的样品，分步洗涤对其纯度的提高更明显。结论：通过 对该包涵体洗涤条件的摸索，找到一种较重复洗涤更有效的分步洗涤方法，既提高了目的纯度又 节约了洗涤时间，为包涵体的洗涤提供了一种新的思路。 关键词　包涵体　脱氧胆酸钠　尿素 中图分类号　Ｑ８１６ 　　利用原核系统表达外源蛋白是重组蛋白产品研发 　　菌体经过物理或化学法裂解后，通过离心获得粗制 和生产的主要途径之一，然而外源基因在原核系统中 包涵体，它除了含有重组蛋白外，也包含一些细菌碎片、 表达的一个显著特点是容易形成包涵体。传统包涵体 外膜蛋白、核酸、脂多糖等杂质，这些杂质的存在会严重 是无生物活性的蛋白聚集体，需要对其变复性后获得 影响目的蛋白的变复性收率、蛋白生物活性和下游纯化 有功能的蛋白。由于蛋白理化性质的复杂性导致了其 过程。如大肠杆菌的外膜蛋白ＯｍｐＴ在变性条件下具有 变复性过程的多样性，因而变复性技术仍然是该领域 蛋白水解酶活性，因而在包涵体溶解过程中可导致重组 ［１］ 研究的难点和重点。变复性前的包涵体洗涤优劣（尤 蛋白的降解 。包涵体洗涤过程中的难点主要是膜蛋白 ［２］ 其是纯度）对后续重组蛋白的变复性有重要影响，直接 和核酸类杂质的去除 ，因而包涵体的洗涤液中多含有 关系到重组蛋白产品最终的质量和成本，因此优化包 一些去垢剂，如ＴｒｉｔｏｎＸ１００，非离子型去垢剂，可除去包 涵体洗涤条件在重组蛋白的生产中应该给予重视。 涵体表面吸附的一些杂蛋白，１％浓度常用于漂洗组织标 ［３］ 本，也有用到２％ 的洗涤浓度；ＮＰ４０和Ｔｗｅｅｎ２０都是非 收稿日期：２０１３０５１０　　修回日期：２０１３０７２５ “十二五”重大新药创制科技重大专项课题资助项 目