人源性防御素hd-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究.pdfVIP

天津医药2014年8月第42卷第8期 755 人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究 1 1△ 1 2 3 张萍萍 尹利荣 王 芳 孙 蓓 霍 彦 【摘要】 目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体，纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以 pcDNA3.1(+)/HD-5为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载 体，并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖 苷(IPTG)诱导表达，对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）鉴定。通过镍柱亲和层析纯 化蛋白并进行蛋白复性，蛋白免疫印迹（Westernblot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对 白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠 杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白；Westernblot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符；KB纸片法证 实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体，经诱导表达后 纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。 【关键词】 防御素类；重组融合蛋白质类；大肠杆菌；防御素-5；原核表达；亲和层析；抗真菌活性 【中图分类号】 R711.3,R349.65 【文献标志码】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.006 ProkaryoticExpressionandAntifungalActivityofHumanαDefensin-5Protein 1 1 1 2 3 ZHANGPingping,YINLirong,WANGFang,SUNBei,HUOYan 1DepartmentofGynecology,theSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211,China;2Research InstituteofEndocrinologyofTianjinMedicalUniversity;3DepartmentofFamilyPlanning,theSecond HospitalofTianjinMedicalUniversity YINLirong,E-mail：yinlirongfk@ [Abstract] Objective ToconstructtheprokaryoticexpressionvectorforHD-5andpurifytherecombinantHD-5 proteinthenanalyzeitsantifungalactivity.Methods TheHD-5genewasclonedbyPCR,thenwasinsertedintoprokary⁃ oticexpressionplasmidpQE-30XatoconstructpQE-30Xa/HD-5.Aftersequencing,pQE-30Xa/HD-5wastransformedin⁃ toE.coliM15cells.ItsexpressionwasinducedbyIPTGandconfirmedbySDS.Therecombinantproteinwaspurified throughNi-NTAaffinitypurifications