家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化结构与活性分析.pdfVIP

中国农业科学 2017,50(14):2837-2850 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.14.019 家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析 1,2,3 2 2 1 1 1 1 1 何华伟 ，王叶菁 ，侯丽 ，李瑜 ，位曙光 ，赵朋 ，蒋文超 ，赵萍 1 2 3 （西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715 ； 西南大学生物技术学院，重庆 400715 ； 西南大学重庆市蚕丝纤维新材料工程技术 研究中心，重庆 400715 ） 摘要：【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种 ALP 的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕（Bombyx mori ）ALP(BmALP)的性质和结构，为揭示ALP 在昆虫体内的生 理功能和调控机制提供依据。【方法】取 5 龄 3 d 家蚕中肠组织，利用 Trizol 法提取总 RNA，然后以其为模板反 转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板，利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物，通过PCR克隆 BmALP。 将 BmALP 与不同的表达载体分别进行双酶切，然后连接并转化表达菌株，利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同 表达载体在上清中的表达情况，选择可溶性重组蛋白表达最好的载体，利用 Origami B (DE3)细胞大量表达重组 蛋白，借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白，然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h，再 次利用Ni-NTA 亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态，利用 圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构 稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA，反转录合成了cDNA，并以该cDNA 为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现，pET32M.3C 载体有助于重组的融合蛋白 His-Trx-BmALP 以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达，然后利用 pET32M.3C载体大量表达重组蛋白，并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission 蛋白酶酶切，再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的 二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构，其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP 的最适 pH 和最适温度分别为 11.0 和 45℃。测定 BmALP 的 Km 值为 1.40 mmol·L-1 。在 10℃处理 2 h 后，BmALP 的 残余活性最高；35℃处理2 h后，其活性完全丧失。Mg2+ 2+ 和Zn 促进了BmALP催化反应的进行，其最适浓度分别为 40和5 mmol·L-1 -1 2+ -1 。在20 mmol·L 浓度范围内，Cu 激活了BmALP活性，其中10 mmol·L 时激活效果最好，浓度超过 20 mmol·L-1 2+ 时，Cu