大豆fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究-广西植物.pdfVIP

广 西 植 物 Guihaia 31(1)：1l1— 116 2011年 1月 DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．O1．023 大豆 fad基 因反义表达载体构建及转化烟草研究 田苗苗，刘艳菊，李 敏，周延清 ，姚换灵，邢延豪 (河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007) 摘 要：使用 PCR方法从大豆基 因组 DNA中扩增出大豆油酸脱饱和酶基因fad2—1，连接到 pMD18一T载体 中，转化大肠杆菌JM109菌株 。测序后 ，用 DNAstar软件进行同源性 比对 。然后将正确的序列反向克隆到表 达载体pBt，并转化农杆菌菌株 LBA4404，经双酶切鉴定和 PCR扩增检测，获得具有该基 因反向序列的农杆 菌工程菌 ，转化烟草无菌苗叶片外植体 ，经过组织培养和卡那霉素抗性筛选 ，获得抗性烟草转化植株共 75株， PCR扩增 出npt—II基因，RT—PCR检测到大豆反义油酸脱饱和酶基因转录产物和 GC-MS测定其油酸含量增 加而亚油酸含量降低。结果表明，克隆的fadZ一1基 因为 l196bp，基因序列与 NCBI中已发表 的基因 d2—1 序列蛋 白质相似性达到 96．7 ，反义大豆fad2—1基因在烟草基 因组中整合表达 。 关键词 ：大豆；反义油酸脱饱和酶基因；根癌农杆菌 ；烟草 ；遗传 中图分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号 ：1000-3142(2011)01一O111—06 StuIy0ntheconstructionofantisenseexpression ‘ n 1 T ● 一 ‘ … vector0f ycm e x oleicacid desatUraSegene anditstransfert0Nicotianatabacum TIANMiao—Miao，LIUYan-Ju，LIMin，ZHOU Yan-Qing ， YAO Huan-Ling．XING Yan_Hao (CollegeofLi Sciences，HneanNormalUniversity，Xinxiang453007，China) A~tmct：TheGlycine1Tta37oleicaciddesaturasegenefad2—1wasclonedfrom itsgenomicDNAbyPCR．Theampli— conwaslinkedtopMD18-T vectorandtransformedintoE．coliJM109．Altersequencing，thecorrectgenewasre— verselyinsertedinpBtexpression vectorinorderto constructplantantisenseexpression vector，whichwastrans— formedintoAgrobacteriumtumefacienstrainsLBA4404byfreeze-thawingmethod．ThemodifiedstrainLBA4404 wasconfirmedbydoublee~ymedigestionandPCRdetection．Theantisensefad2—1wasintroducedintotobaccoby Agrobacteriumtumefaciens—mediatedleafdisctransformation，and75kanamycin-resistanttobaccoplantpletswerere— generated．PCR，RT-PCRmethodsandGC-MSanalysiswereusedtO detectthenpt-IIgene，thetranscriptofanti— sensefad2—1andole