铜绿假单胞菌外膜蛋白oprf原核表达载体的构建-中国医院药学杂志.pdfVIP

　第４８卷　第９期 山　东　大　学　学　报　（医　学　版） ２０１０年９月　 　Ｖｏｌ．４８　 Ｎｏ．９　　　　　ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＨＡＮＤＯＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＨＥＡＬＴＨＳＣＩＥＮＣＥＳ）　　　　　 Ｓｅｐ．２０１０　 　文章编号：１６７１－７５５４（２０１０）０９－００３４－０６ 铜绿假单胞菌外膜蛋白ＯｐｒＦ原核 表达载体的构建及表达 １ ２ １ 王燕 ，窦恒利 ，胡成进 （１．济南军区总医院实验诊断科，济南２５００３１；２．济南市立四院胸外科，济南２５００３１） 摘要：目的　克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白ＯｐｒＦ基因，构建原核表达载体并鉴定表达。方法　从铜绿假单胞菌中 提取基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增ＯｐｒＦ羧基端，克隆至原核表达载体ｐＥＴ２８ｂ中，构建重组表达载体ｐＥＴ２８ｂＦ。重组质 粒经酶切和序列测定后，转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１，异丙基Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达，进行 ＳＤＳＰＡＧＥ检测。 β 经ＮｉＮＴＡ亲和层析柱纯化后ＯｐｒＦ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ＥＬＩＳＡ方 法进行鉴定。结果　ｐＥＴ２８ｂＦ原核表达载体构建成功。重组表达质粒经ＩＰＴＧ诱导后表达外膜蛋白ＯｐｒＦ。获得 ４株高分泌型特异性单克隆细胞株，其中２株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ试剂盒，检测铜绿假单 胞菌。结论　成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白ＯｐｒＦ羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达，筛选出特异性抗 ＯｐｒＦ单克隆抗体。 关键词：假单胞菌，铜绿；原核细胞；抗体，单克隆；膜蛋白质类 ＋ 中图分类号：Ｒ３７８．９９１　　　文献标志码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｖｅｃｔｏｒｅｎｃｏｄｉｎｇｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎＯｐｒＦｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １ ２ １ ＷＡＮＧＹａｎ，ＤＯＵＨｅｎｇｌｉ，ＨＵＣｈｅｎｇｊｉｎ （１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＤｉａｇｎｏｓｉｓ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｎａｎＭｉｌｉｔａｒｙＡｒｅａ，Ｊｉｎａｎ２５００３１，Ｃｈｉｎａ； ２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｈｏｒａｃｉｃＳｕｒｇｅｒｙ，ＪｉｎａｎＦｏｕｒｔｈＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｎａｎ２５００３１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｃｌｏｎｅｔｈｅｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎＯｐｒＦｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ），ａｎｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙａｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅＤＮＡｇｅｎｏｍｅｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＰＡ，ａｎｄｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｔｈｅＯｐｒＦｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｒｉｍｅｒｓｏｆＰＣＲ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ２８ｂＦｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙ ｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅＯｐｒＦｃＤＮＡｉｎｔｏｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ２８ｂ．Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅ ａｓｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｐＥＴ２８ｂＦｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ． Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔ