锌α2糖蛋白真核表达载体的构建和体外表达鉴定-中国医学科学院.pdfVIP

中 国 医 学 科 学 院 学 报 ＡＣＴＡＡＣＡＤＥＭＩＡＥＭＥＤＩＣＩＮＡＥＳＩＮＩＣＡＥ ·论　著 · 锌 糖蛋白真核表达载体的构建和体外表达鉴定 α ２ 张韶君，龚凤英，邓洁英，朱惠娟，潘　慧，张殿喜，李乃适 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室，北京１００７３０ 通信作者：龚凤英　电话：０１０传真：０１０电子邮件：ｆｙｇｏｎｇ５０７４＠ｙａｈｏｏｃｏｍｃｎ 　　摘要：目的　构建小鼠锌 糖蛋白 （ｍＺＡＧ）真核表达载体，在体外培养细胞中鉴定其ｍＲＮＡ和蛋白水平表达。 α ２ 方法　提取小鼠肝组织总ＲＮＡ，采用ＲＴＰＣＲ法扩增ｍＺＡＧ全基因表达序列，酶切法将ｍＺＡＧｃＤＮＡ全序列插入表达质 粒载体ｐｃＤＮＡ３１（）中构建ｐｃＤＮＡ３１（）ｍＺＡＧ真核表达质粒。采用阳离子脂质体转染法将不同浓度 ｍＺＡＧ表达 质粒 （０、０４、０８、１６ ｇ）ｐｃＤＮＡ３１（）ｍＺＡＧ和４对ｍＺＡＧ小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）序列转染到３Ｔ３Ｌ１前脂肪细 μ 胞中，实时荧光定量ＲＴＰＣＲ测定ｍＺＡＧｍＲＮＡ表达水平，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｍＺＡＧ蛋白表达情况。结果　测序鉴定证实 成功构建ｍＺＡＧ真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３１（）ｍＺＡＧ。实时荧光定量 ＲＴＰＣＲ检测结果显示，０４、０８、１６ ｇｍＺＡＧ μ 转染组３Ｔ３Ｌ１细胞中的ｍＺＡＧｍＲＮＡ表达水平分别是０ｇｍＺＡＧ转染组的２５８（Ｐ＝０００２）、３６７（Ｐ＝００００）、５１９ μ 倍 （Ｐ＝０００１）；ｍＺＡＧｓｉＲＮＡ１组和ｍＺＡＧｓｉＲＮＡ４组小鼠３Ｔ３Ｌ１细胞中的ｍＺＡＧｍＲＮＡ表达水平显著减少，分别是不 转染ｍＺＡＧｓｉＲＮＡ干扰序列对照组的４９％ （Ｐ＝０００２）和４１％ （Ｐ＝００００）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示，０８ｇｍＺＡＧ μ 质粒转染组的体外ｍＺＡＧ蛋白表达水平是不转染 ｍＺＡＧ质粒对照组的２７５倍 （Ｐ＝００１７）；ｍＺＡＧｓｉＲＮＡ１和ｍＺＡＧｓｉＲ ＮＡ４干扰序列转染组的体外ｍＺＡＧ蛋白表达水平仅为对照组的５５％ （Ｐ＝０００４）和６２％ （Ｐ＝００２５）。结论　成功构建 ｍＺＡＧ真核表达载体，该载体能够在体外细胞中良好表达。筛选出能够显著抑制ｍＺＡＧ表达的ｓｉＲＮＡ１和ｓｉＲＮＡ４，为今 后进一步深入研究ＺＡＧ提供了有用工具。 关键词：锌 糖蛋白；３Ｔ３Ｌ１细胞；小干扰ＲＮＡ；质粒构建 α ２ 中图分类号：Ｒ５８９２　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１０００５０３Ｘ（２０１０）０３０２８３０６ ＤＯＩ：１０３８８１／ｊｉｓｓｎ１０００５０３Ｘ２０１００３０１０ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＺｉｎｃ２ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｌａｓｍｉｄａｎｄ α ＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ３Ｔ３Ｌ１Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔ