SOP-SC-0501细胞DNA提取操作规程.PDF

最佳实践规范及标准操作流程文件汇编 V2.01 上海生物样本库 最佳实践规范及标准操作流程 文件汇编 （第二版） 2010年5月 最佳实践规范及标准操作流程文件汇编 V2.01 上海生物样本库 质量管理体系文件 文件名称 细胞DNA提取操作规程 编号 SOP-SC-053-01 批 准 人 批准日期 实施日期 细胞 DNA 提取操作规程 1.目的 规定从细胞中提取DNA实验应遵守的操作。 2.适用范围 使用与从细胞中提取DNA的操作。 3.定义和术语 3.1 DNA Deoxyribonucleic Acid 即脱氧核糖核苷酸,是遗传信息储存及传递者。 4.职责 4.1 样本库实验技术员负责从细胞中提取DNA。 5.设备和器材 见正文内容 6.正文 6.1 试剂准备 6.1.1所需试剂： 氯仿、EDTA、无水乙醇、70%乙醇、苯酚、1xPBS、蛋白酶K、TE缓冲液。 6.1.2 Tris-EDTA 1M Tris, pH 8.0, 20ml 0.5M EDTA, 20ml 无菌水 6.1.3蛋白酶K (20mg/ml) 将200mg蛋白酶K加入到10ml TE缓冲液，室温下放置20分钟。分装后-20 1 最佳实践规范及标准操作流程文件汇编 V2.01 ℃贮存。 6.2 新鲜血样中收集血细胞 6.2.1将细胞转移至离心管中，在4℃下1500g离心10分钟以收集细胞。 6.2.2吸去上清，用1倍体积冰冷TBS重悬细胞并再度离心。吸去上清，小 心地再次于冰冷TBS中重悬细胞，离心收集细胞。 7 6.2.3吸去上清，小心用TE (pH8.0)重悬细胞至5x10 个/ml，转移上清至三 角锥瓶。 6.2.4 每毫升细胞悬液加 10ml 裂解缓冲液，于 37℃下温育 1 小时，立即进 行DNA提取。 6.3 DNA 提取（酚-氯仿法） 6.3.1 将裂解液移至一个或多个适合离心机的离心管中，裂解液不能超过 1/3体积。 6.3.2 加入蛋白酶（20mg/ml）至终浓度100ug/ml。用玻棒温和将酶混入裂 解液中。 6.3.3 将裂解液置于50℃水浴中3小时，不时旋转溶液。 6.3.4 将溶液冷却至室温，加入等体积的 0.1M Tris.Cl (pH8.0)平衡过的 苯酚。将离心管缓慢颠转 10 分钟温和地混合两相。将离心管置于旋转器上 1 小 时。 6.3.5室温下5000g离心15分钟分离两相。 6.3.6将黏滞的水相（上层）转移至另一离心管。 6.3.7用苯酚在抽提两次，收集水相。 6.4 DNA分离 6.4.1第三次苯酚抽屉后，将水相转移至另一离心管中。加入0.2倍体积10M 醋酸氨及2倍体积乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀。 6.4.2 DNA随即形成沉淀，在室温5000g离心5分钟收集沉淀。 6.4.3用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，在室温5000g离心5分钟收集沉淀。 6.4.4尽可能使用真空泵吸去残余的乙醇。于室温将DNA沉淀置于敞开的管 内，直至可见的