一种用于优化pcr引物设计的短链dna熔点分析方法.pdfVIP

ＩＳＳＮ　 １００７⁃７６２６ 中国生物化学与分子生物学报　 ｈｔｔｐ：／ ／ ｃｊｂｍｂ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ２０１６年１０月 ＣＮ　 １１⁃３８７０／ Ｑ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２（１０）：１１６８～１１７６ ·技术与方法· ＤＯＩ：１０１３８６５／ ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｂｍｂ 一种用于优化ＰＣＲ 引物设计的短链ＤＮＡ熔点分析方法 王　 静，　 范慧君，　 梁兴国∗ （中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛　 ２６６００３） 摘要　 目前，ＰＣＲ 引物设计主要依赖于软件对引物熔点的模拟计算，而ＰＣＲ退火条件的优化需进 行不同条件下的扩增实验。 为开发一种可高效、精确评价引物和确定退火条件的方法，本研究采用 高分辨率熔解曲线（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ，ＨＲＭ）测定技术直接分析短链ＤＮＡ 的熔点，用于引物优 劣性的评价，并为退火条件的优化提供参考。 本文用ＨＲＭ 法直接测定了非完全互补的双链ＤＮＡ 以及ＤＮＡ发卡结构的熔点，结果显示：（１）与完全互补的双链ＤＮＡ相比，较为稳定的单碱基错配Ａ ∙Ｇ、Ｇ ∙Ｇ和Ｔ ∙Ｇ的熔点只降低２℃ ～３℃，部分双碱基错配的熔点只降低４℃ ～６℃，单碱基突出 熔点只降低４℃ ～５℃。 因此，如果采用的退火温度不当，部分错配的非目的模板可能会被扩增。 （２）即使发卡结构的茎干区只有６ ｂｐ，当其环区碱基少于１０ ｎｔ 时，其熔点也可达到６０℃以上。 此 外，环区的长度对发卡熔点也有较大影响。 根据本研究结果发现，引物设计时应尽量避免模板引物 结合区同其邻近的３０ ｎｔ碱基有６ ｂｐ 以上的互补部分。 综上所述，本研究证明ＨＲＭ熔点法是一种 高效评价引物及确定退火温度的方法。 关键词　 引物；熔点；短链ＤＮＡ；高分辨率熔解曲线；发卡 中图分类号　 Ｑ５⁃３３ Ａ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ＷＡＮＧＪｉｎｇ，ＦＡＮ Ｈｕｉ⁃Ｊｕｎ，ＬＩＡＮＧ Ｘｉｎｇ⁃Ｇｕｏ∗ （Ｃｏｌｌａｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６００３，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ　 Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ， ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｔｏ ｂｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ （Ｔ ｓ） ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｍ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ （ＨＲＭ） ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ａｓ ａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｍｅａｎｓ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＨＲＭ ｗａｓ ｃａｐａｂｌｅ ｔｏ ｍｅ