桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的克隆和原核表达-中国科技论文在线.PDF

东南大学学报 医 学版 outheastUniv MedScEd、 一… r’ 。， 90。 JS ?2004，Sep；23(5)：287-2 · 287 · Univ (M edSciEdi 桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的 克隆和原核表达 王飞 ，潘永正 ，李光富 ，DavidR．Garrod (1．东南大学附属中大医院 皮肤科，江苏南京 210009；2．南京医科大学 病原生物学系，江苏 南京 210029； 3．英国蔓彻斯特大学 生物学系，蔓彻斯特，英国) [摘要]目的：克隆人桥粒芯胶蛋白3前导肽(Dc3p)基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法从桥粒芯胶蛋白(Dc)cD— NA文库中扩增出Dc3p基因，与pGEX一4T一2栽体连接成重组表达质粒pGEX-4T-2／Dc3p；重组质粒转入 BI21大肠杆菌，经诱导表 达谷胱甘肽 s-转移酶一Dc3p(GST-Dc3p)融合蛋白，该蛋白经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化，sDs和免疫印迹法检 测鉴定。结果：经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX一4T一2／Dc3p成功构建，诱导后高表达GSI-Dc3p融合蛋白并得到纯化 ，免 疫印迹法证实表达蛋白为GSY-Dc3p。结论：获得高表达、高纯度的GSr—Dc3p融合蛋白，为1)c3p的功能及免疫学分析打下基 础 。 [关键词]桥粒；桥粒芯胶蛋白3；基因克隆；基因表达 【中国分类号]Q785；Q786 【文献标识码]A [文章编号]1671-6264(2004)05-0287-04 桥粒是上皮细胞特有的一种细胞间粘着结构，发 DNA凝胶纯化试剂盒为QIAGEN公司产品。 挥着细胞与细胞问的连接及信号传导作用。桥粒芯胶 1．1．3 抗体 蛋白(desmocollin，Dc)是桥粒的主要组成成分，包括 兔抗 Dc3前导肽抗体 (英国蔓彻斯特大学David Dcl、De2、De3亚型 】。De3主要分布在皮肤的基底 R．Garrod教授惠赠)，二抗为HRP标记的羊抗兔抗体 层，在银屑病 、日光性皮肤病及天疱疮等疾病的发病中 (武汉博士德公司)。 起重要作用。皮肤桥粒结构的破坏将引起角质形成细 1．2 方法 胞松解，形成表皮内裂隙和水庖l3J。作者采用 PCR 1．2．1 重组体的构建 技术克隆出了De3前导肽 (theprecursorsegmentof 1．2．1．1 PCR扩增 Dc3p基因 以Dc3cDNA为模板， desmocollin3，Dc3p)基因，并表达、纯化Dc3p，为进一步 根据 Kawamura等 报道已知序列设计引物，上游引物 研究Dc3p的功能奠定基础。 为 5一GCGGGATCCGCCI；GCAAA从GGTGATACn ATG TAC一3，下游 引物为 5 GCGGAAITCCCTCTIG． l 材料和方法 GCACGCCTGAGAAC一3，其上下游引物分别含有 BamH 1．1 主要试剂和材料 I、EcoRI的酶切位点和保护性碱基(以上引物均由 1．1．1 菌株和质粒 上海申能博采公司合成)。50 PCR反应体系中含 质粒 pGEX一4T一2(Pharmacia公司)、大肠杆菌 1ttlpfuDNA聚合酶、1g模板、各1ttl(100pmol。L )的 DH5a、BL21由南京医科大学分子生物研究所提供， 上下游引物。PCR循环参数为：95c=【预变性 5rain后 Dc3cDNA由英国蔓彻斯特大学生物学系DavidRGar． 95℃变性60s，60℃复性45S，72℃延伸60s，循环次数 rod教授惠赠。 为35次，末次延伸为72qC10min。PCR产物经琼脂糖 1．1．2 酶及其他试剂 凝胶电泳鉴定、凝胶纯化试剂盒纯化。 BamH I、EcoR