淀粉酶活测定实验报告.docVIP

班级：植物092 姓名：徐炜佳 学号：0901080223 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶α-淀粉酶α-淀粉酶α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3?,5二水杨酸比色法和降落值法?。这3?种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α淀粉酶、萌动种子α淀粉酶和后熟面粉的α淀粉酶活性测定方法优点缺点DNS 灵敏、准确、精确度高,适宜精确测量小样品α淀粉酶活性大小测定步骤较繁,不便分析大量样品,测定范围较窄凝胶扩散法简便、快速、省时、省力,消耗材料和药品较少,不需要特殊仪器,测定范围较宽边界不清晰,灵敏度与准确度较低,不适宜精确测量α淀粉酶活性的大小降落值法快速、省时、重现性好、平行性好、消耗的药品少,适宜于测量大量样品消耗的材料多,间接测定α淀粉酶活性大小α-淀粉酶 4. 麦芽糖的测定 ⑴标准曲线的制作 取15ml具塞试管7支，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，用蒸馏水补充至1.0ml，摇匀后再加入3，5-二硝基水杨酸1ml，摇匀，沸水浴中准确保温5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 ⑵样品的测定 取15ml具塞试管8支，编号，分别加入步骤2和3中各管的溶液各1ml，再加入3，5-二硝基水杨酸1ml，摇匀，沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录消光值，根据标准曲线进行结果计算。 五、数据整理及计算 麦芽糖标准液浓度mg/ml 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0 OD520 项目 α(测) α(测) α(对) α(对) α+β(测) α+β(测) α+β(对) α+β(对) OD520 平行组数据均值OD520 样品麦芽糖浓度mg/ml 上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），计算上表中第4行数据（各样品的OD值）均值，填入上第5行中，根据标准曲线的方程，计算第5行OD值所对应的麦芽糖浓度，填入最后一行，如上表。 根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性： A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度 A’——α-淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度 B——(α-+β-)淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B’——(α-+β-)淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 计算结果如下： α-淀粉酶活性= （毫克麦芽糖?克-1鲜重?分钟-1） (α-+β-)淀粉酶活性= （毫克麦芽糖?克-1鲜重?分钟-1） β-淀粉酶活性= （毫克麦芽糖?克-1鲜重?分钟-1） 六、结果分析 七、思考题 1、酶活力测定实验的总体设计思路是什么？实验设计的关键你认为是什么？为什么？ 答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶活性，通过测酶促反应的产率推算酶活力大小。 关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或避免其它酶产物给测定结果带来的误差。 2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是哪些步骤？为什么？怎样的操作策略可以尽量减少误差？ 答：①浸提步骤。70℃温度或15min时间控制不严格不准确则可能导致β淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。②70℃水浴后需要立即冰浴，否则β淀粉酶复性使测得α淀粉酶活性结果偏大。③向测定管中加入NaOH时应迅速，否则酶与底物继续反应使结果偏大。 3、(-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤冷？ 答：由于(-淀粉酶不耐热，在70℃下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间