端粒酶逆转录酶小干扰rna对胰腺癌capan-上海核学会-中国.docVIP

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对胰腺癌Capan-2细胞抑制作用的实验研究 倪晶;夏伟;庄菊花;吴翠华;沈金秀 1.上海市第七人民医院核医学科,200137 【摘要】　目的：探讨RNA干扰（RNAi）对胰腺癌Capan-2细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的抑制效应。方法：化学合成靶向于hTERT基因的４个小分子干扰RNA（siRNA）序列，用阳离子脂质体为载体转染Capan-2细胞，分为siRNA1～4、siRNA阴性对照和空白对照6组。通过RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测胰腺癌细胞转染后细胞hTERT　mRNA和蛋白水平，并用MTS法检测细胞生长增殖。结果：siRNA1～4组hTERT　mRNA相对表达量分别为0.51±0.22、0.56±0.19、0.44±0.13和0.89±0.21，端粒酶相对活性分别为0.60±0.15、0.63±0.16、0.17±0.12和0.72±0.16，siRNA１～４组hTERT蛋白相对表达量分别为0.47±0.21、0.52±0.19、0.10±0.11和0.84±0.15，其中siRNA1～3组的hTERT　mRNA表达量、端粒酶活性和蛋白表达量与空白对照组的差异有统计学意义，P＜0.05。Capan-2细胞在转染后48h时的细胞增长平均抑制率分别为50％、54％、63％和18％。提示不同siRNA序列对Capan-2的转染效率不同，其中siRNA３组能显著下调hTERT　mRNA和蛋白的表达水平，并能抑制端粒酶活性和促进Capan-2细胞凋亡，与空白对照组比较均差异有统计学意义，P0.01。结论：靶向hTERT的RNAi能明显抑制Capan-2细胞的增殖，hTERT可作为胰腺癌基因治疗的靶点。 [关键词] 胰腺;RNA干扰;端粒酶 胰腺癌具有临床症状隐匿、病情进展快、早期诊断困难、预后差等特点。在全球范围内，病死率与发病率之比高达0.991[1]。在过去的几十年里，胰腺癌的治疗方法以及患者生存时间并未得到明显的提高和改善。随着分子生物学和基因组学的发展，尤其RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术的发现，有望为胰腺癌的治疗提供一种新的有效方法。研究发现，端粒酶与细胞的永生化及癌变密切相关，它的激活对肿瘤的发生和发展起着重要作用［２］。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是端粒酶的核心催化亚单位，在我们的前期研究中证实了通过ＲＮＡｉ技术下调肝癌Hep G2细胞和结肠癌sw480细胞的hTERT表达水平，可促进Hep G2细胞和sw480的死亡和凋亡［2,3］。但目前罕见靶向敲除hTERT对胰腺癌capan-2细胞增殖影响的报道，因此本研究利用RNAi技术靶向敲除capan-2细胞的hTERT，分析其对capan-2细胞增殖的影响，探讨其治疗胰腺癌的潜在价值。 １　材料与方法 1.1　材料 capan-2细胞由中国科学院上海生命科学研究院购得，用含体积分数10%胎牛血清（Gibco）和100Ｕ/mL青霉素和链霉素的DMEM（Gibco）培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，维持对数生长期备用。 1.2　小分子干扰RNA的设计与合成 利用小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）靶点寻找工具（/techlib/misc/siRNA_finder）设计hTERT mRNA（GeneBank accession no.AF015950）开放可读框内靶向特定序列的4个不同siRNAs。所选siRNA序列进行BLAST检索以排除与人基因组其他序列结合。4个hTERT-siRNA序列分别为：siRNA1：正向链5’-3’:CAUGCGUCGCAAACUCUUUTT，反向链5’-3’:TTGUACGCAGCGUUUGAGAAA；siRNA2:正向链5’-3’:AUGCGGCCCCUGUUUCUGGTT，反向链5’-3’:TTUACGCCGGGGACAAAGACC；siRNA3：正向链5’-3’:GAGCCAGUCUCACCUUCAATT，反向链5’-3’GTCUCGGUCAGAGUGGAAGUU；siRNA4：正向链5’-3’:CGGUGUACGCCGAGACCAATT，反向链5’-3’:GGGCCACAUGCGGCUCUGGUU。siRNAs由上海吉玛制药技术有限公司（GenePharma,Shanghai）合成，每个siRNA在无菌无RNA酶的水中重悬，稀释到合适的工作浓度（20μmol/L）并储存于-80℃备用。实验分为６组，分别为siRNA1～4治疗组，1个阴性对照组和1个空白对照组，其中阴性对照组由与已知人类mRNA无有效同源的杂乱阴性siR