生物化学试验指导-扬州大学医学院留学生教育.doc

生物化学实验指导 （临床医学、临床药学、护理、中医等专业用） 周晓霞 程 宏 王树强 编写 扬州大学医学院生物化学教研室 ２００６年６月 生 物 化 学 实 验 须 知 1．生物化学实验有其独特的实验技能和基本操作，课前必须认真预习，明确实验目的、原理、操作关键步骤及注意事项，做到心中有数。 2．自觉遵守课堂纪律，不迟到、早退；保持室内安静，不高声谈笑，同学间应互助友爱。 3．实验时应本着积极认真的态度，在教师的指导下完成每次实验。注意观察实验过程中出现的现象和结果，并对实验结果展开讨论。结果不良时，必须重做。 4．实验中，要听从老师指导，严格遵守操作规程，试剂用完后应立即盖严，放回原处。并应及时将实验结果和原始数据如实记录在实验报告上，按时写出实验报告并及时上交。 5．实验后，必须把玻璃仪器洗净放入仪器柜内；清扫实验台面、地面；试剂瓶要摆放整齐。要经常保持实验室内清洁，不乱丢纸屑及所有固体废弃物。 6．爱护实验器材，非本次实验使用的仪器设备未经老师允许不得乱动。本次实验必须使用的仪器设备，在了解仪器性能和操作规程之前，不得贸然使用，更不可擅自拆卸或将部件带出室外。实验过程中，如发现设备损坏或运转异常，应立即报告老师。 7．实验室内严禁吸烟。对腐蚀性或易燃性试剂，操作时要格外小心。如酒精、乙醚等低沸点有机溶剂，使用时应禁明火，远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。若发生酸碱灼伤事故，立即用大量自来水冲洗。 8．每次实验课由学生轮流值日。值日生要负责打扫实验室的卫生，关好门窗经老师检后，方可离开实验室。 ) 管 号 1(空白) 2 3 蒸馏水 2%硫酸铜 5.0 2.5 0 0 2.5 5.0 2．混匀，于650nm处比色，并记录数值。 3．关机，清洗比色杯，倒置于比色杯架上，晾干。 [常用生化仪器] 1.烧杯(beaker) 2.试管(test tube) 3.离心管(centrifuge tube) 4.刻度吸量管(scaled pipet) 5.滴管(dropper)、搅棒(stirringrod) 6.漏斗(funnel) 7.混匀器(vortex) 8.恒温水浴箱(waterboth) 9.离心机(centrifuge) 10.分光光度计(spectrophotometer) 11.可调式移液器(pipettman) [思考题] 1．判断玻璃仪器清洗干净的标准是什么? 2．简述刻度吸管的正确使用方法；若量取0.4ml液体，应选取哪种规格的刻度吸量管? 3．离心操作的基本原则是什么?如何才能做到? 4．简述分光光度法测定物质浓度的原理。 5．试述722分光光度计的使用步骤。 实验二 血清蛋白的盐析与定量 [目的与要求] 1．掌握盐析的原理和方法。 2．掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。 3．了解血清蛋白质定量测定的临床意义。 [实验原理] 在蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质就会被沉淀，这种作用称为盐析。其机制与下列因素有关：高浓度的盐离子可与蛋白质分子争夺表面水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离，使蛋白质带电量减少。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白质变性，经透析或加水稀释后仍可溶解，盐析是可逆过程。 正常人的血清蛋白中清蛋白占绝大部分，约60％以上，其余为球蛋白，两者比例为1.5～2.5∶1。清蛋白在水中的溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。 蛋白质含量的测定是利用双缩脲法，其基本原理是：蛋白质（或肽）分子中含有许多肽键，与双缩脲结构（H2NOC-NH-CONH2）类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫红色的化合物（称双缩脲反应）。在一定的浓度范围内，化合物的颜色深浅与蛋白质（或肽）的含量成正比，故可用比色法测定蛋白质（或肽）的含量。因含有肽键的物质才有此反应，故氨基酸不能用此方法测定含量。 正常血清中含有多种蛋白质，其总量为6-8g/100ml。在某些病理情况下，如营养不良，肝脏疾患，可因蛋白质合成减少，或因肾病综合征，由于蛋白质从尿中流失而降低；而在严重脱水情况下，由于血液浓缩可致测出结果增高。血清蛋白浓度升高不如其降低的临床意义大，而清/球比值的改变更具有临床意义。 [操作步骤] (一)血清蛋白的盐析 1．取1ml未知血清加入离心管，逐滴滴加饱和硫酸铵1ml，边加边混匀，(观察现象)。 2．室温静置5分钟后，3000rpm，离心7分钟，将上清小心移入样品收集管内。 3．盐析