罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性.pdfVIP

第35 卷 第 6 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.35, No.6 2 0 1 4 年 1 2 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Dec., 2014 DOI: 10.11758/yykxjz / 罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因 体外表达及其免疫原性* 王 蓓1,2,3 李桂欢1,2,3 王 培1,2,3 汤菊芬1,2,3 鲁义善1,2,3 吴灶和2,3,4 简纪常1,2,3① (1. 广东海洋大学水产学院 湛江 524088; 2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 湛江 524088; 3. 广东省水产经济动物病害控制重点实验室 湛江 524088; 4. 仲恺农业工程学院 广州 510225) 为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin, Hly)对鱼体的免疫保护作用，根据已获得的 无乳链球菌ZQ0910 全基因组序列设计引物扩增hly 基因，定向克隆于原核表达载体pET-28a 中， 构建原核重组质粒pET-28a-hly ，经IPTG 诱导表达后，制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼，并分析疫 苗的免疫保护力。结果显示，hly 基因产物大小 1335 bp，编码444 个氨基酸，经测序与GenBank 报道的链球菌属Hly 氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG 诱导表达后，SDS分析可见一条 51.7 kD 的特异条带；Western blotting 分析结果说明表达的Hly 蛋白能与His-Tag 单抗特异性结合； 制备的亚单位疫苗免疫鱼体后第 14 天即可检测到抗体产生，并在第28 天达到峰值，抗体效价 为1 ∶4096 ，免疫保护率为70%。由此证实，该亚单位疫苗有望成为预防由无乳链球菌引起的罗非 鱼链球菌病的基因工程类疫苗。 无乳链球菌；溶血素；原核表达；免疫原性 S917 文献标识码 A 文章编号 1000-7075(2014)06-0060-08 罗非鱼(Oreochromis nilotices) ，又称“ 白色三文 的表面蛋白在细菌侵染机体时，首先粘附于上皮细 鱼” ，是联合国粮农组织推荐的21 世纪最有发展前景 胞，并通过与宿主细胞外基质或血浆蛋白相互作用来 的淡水养殖品种(雷光英等, 2009; 储霞玲等, 2012) ， 逃避宿主的免疫监视，目前已相继报道多种致病蛋白， 然而随着高密度养殖和环境日益恶化，病害日趋严 包括表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic protein, 重，造成的损失逐年增加。从 2009 年至今，罗非鱼 Sip)、cpB 蛋白、Lmb 蛋白等(沈定数等, 2007)。此外， 链球菌病在我国罗非鱼多个主养区泛滥，发病率及死 链球菌的某些分泌性蛋白也可能在致病过程中起到 亡率高，并由传统的高温时节发病演变为全年大部分 至关重要的作用，这些分泌性蛋白一旦达到一定的浓 时间均可发生，部分地区发病率和死亡率可达 90% 度，就可以发挥作用(Baums et al, 2009) 。其中最重要 (林庆强, 2010) 。 的分泌性蛋白就是溶血素(Hemolysin, Hly) ，它作为一 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) 是一种革 种公认的毒力因子，在动物细菌性疾病的感染发展过 兰氏阳性链球菌，是近年来引起我国南方地区罗非鱼 程中起着重要作用(Gottschalk et al, 2000、2007) ，并 链球菌病的主要病原菌之一(Wang et al, 2012) 。该菌 且有研究表明，在猪链球菌不同血清型中产生的溶血 * 国家自然