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凋亡素参与的肿瘤细胞及正常细胞核蛋白表达差异 研究1 董兴丽，刘岩，郑天虎，张宇雯，李冀宏，刘兴汉* 哈尔滨医科大学 生物化学与分子生物学教研室，黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共 建国家重点实验室培育基地，哈尔滨（150086 ） E-mail：hmudxl@ 摘 要：研究凋亡素参与的肿瘤细胞及正常细胞核蛋白表达差异。采用脂质体介导 pEGFP-C1-apoptin 转染HepG2 细胞和L02 细胞，利用激光共聚焦检测凋亡素在两种细胞中 的定位情况，而后分别提取转染后两种细胞的胞核蛋白，对其进行双向电泳的进一步分离鉴 定。激光共聚焦检测显示，在脂质体的介导下成功完成凋亡素在转染细胞中的高表达。转染 24 小时后，凋亡素定位在肿瘤细胞和正常细胞的细胞核内，均不会引起两种细胞的凋亡； 转染48 小时后，凋亡素从正常细胞核内出来在胞质中聚集，不引起正常细胞凋亡，而仍定 位于肿瘤细胞的核内，聚集，引起肿瘤细胞的特异凋亡。完成两组转染后核蛋白的提取纯化 工作，进行双向电泳分离核蛋白，找到两种细胞的差异点。 关键词：凋亡素；转染；激光共聚焦显微镜；双向电泳 中图分类号：R73-3 1．引言 凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非 P53 依赖的，而 不能够导致正常细胞的凋亡，这与凋亡素的核定位有关[1-2] 。凋亡素是一种在细胞质与细胞 核之间穿梭的蛋白。无论是在肿瘤细胞还是正常细胞内，凋亡素都能够通过核定位信号进入 细胞核。然而在肿瘤细胞中，凋亡素被修饰，导致出核信号的失活，定位在细胞核内，引起 肿瘤细胞的凋亡；而在正常细胞中，凋亡素又通过出核信号出核，定位在细胞浆内，不引起 正常细胞的凋亡[3] 。 综上所述，肿瘤细胞与正常细胞之间的蛋白表达一定存在着某种差异，使得凋亡素在肿 瘤细胞中被特异地修饰。本实验通过蛋白质组学的方法来寻找肿瘤细胞与正常细胞核内的蛋 白表达差异，以期望能够进一步探讨凋亡素诱导肿瘤细胞特异凋亡的机制。 2 ．材料和方法 2.1 实验材料 PureyieldTM Plasmid Midiprep System(Promega) 、RPMI1640 细胞培养基、新生 牛血清（GIBCO ）、转染试剂LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)、蛋白酶抑制剂（sigma ）、 pEGFP-C1 、pEGFP-C1-apoptin 由伦敦大学医学院Tavassoli 博士惠赠，JM109 菌株由本室保 存，HepG2 细胞、L02 细胞由本校遗传教研室馈赠。 2.2 pEGFP-C1-apoptin 载体的提取 按照Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取试剂盒进行质粒的提 取。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20060226020 ）的资助。 -1- 2.3 细胞培养 用含RPMI1640、10%新生牛血清的培养液，置 37℃、5%CO2 及饱和湿度的恒温箱中 培养HepG2 细胞、L02 细胞，每2d 传代一次。 2.4 细胞转染 进行24 孔板贴壁细胞的瞬时转染，将pEGFP-C1-apoptin 质粒分别转染进HepG2 和L02 两种细胞。 2.5 激光共聚焦检测apoptin 定位 转染后24、 48h 将 24 孔细胞培养板取出,在各组细胞的培养基中加入 Hoechst 33342 染液(终浓度为 10µ g/ml), 37 ℃恒温避光染色 15min, PBS 洗 3 次,去除未结合的 Hoechst 33342, 激光共聚焦荧光显微镜下观察,拍照。 2.6 细胞核蛋白提取 用含RPMI1640、10%新生牛血清的培养液，置 37℃、5%CO2 及饱和湿度的恒温箱中 培养转染24h 、48h 后的HepG2 细胞、L02 细胞。收集上述细胞，常规消化，用PBS(ph7 .2) 洗1 次，4 ℃ 1080rpm 离心5min 。弃上清，细