基于p62／sqstmluciferase的细胞自噬水平检测方法的建立及鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３６（１）：５５６２ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 基于ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ的细胞自噬 水平检测方法的建立及鉴定 １，２ ２，３ ２，３ 赵远波 　洪杜北琦 　陈英玉 （１贵州医科大学生物与工程学院　贵阳　５５００２５　２北京大学基础医学院　北京　１００１９１） （３北京大学人类疾病基因研究中心　北京　１００１９１） 摘要　自噬是细胞依赖溶酶体对大批量蛋白质和细胞器进行降解的一条重要途径。目前已发现 很多基因和自噬过程相关，但是对自噬过程的分子机制尚未明了，因此建立自噬检测方法进行新 的自噬相关分子的鉴定显得尤为重要。构建了选择性自噬底物ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１（Ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ１）和 萤火虫荧光素酶报告基因融合表达的重组质粒，通过检测细胞内荧光素酶的活性来分析细胞自 噬流，建立了一个简单且适用于通量化筛选的细胞自噬检测方法，为进一步的高通量自噬分子的 筛选奠定了基础。 关键词　自噬　ＳＱＳＴＭ１　荧光素酶　ｐ６２ 中图分类号　Ｑ２５１ 　　细胞自噬是对细胞内长寿命蛋白质和受损细胞器 膜如何扩展、选择性自噬的调控机制和参与自噬的协 进行自我消化的现象，是真核生物中普遍存在的一种 同调控的分子等［１，７］。其中一个限制性因素是缺乏有 ［１］ 保守的细胞行为 。自噬过程中出现由双层膜形成的 效的细胞内自噬水平的检测方法。 泡状结构，其中包裹着细胞器和部分细胞浆，最终和溶 　　以前认为自噬降解过程对其底物没有特异性，现 酶体融合使其内容物降解，这一完整的过程称为自噬 在已经证明自噬对其底物有一定选择性，这种选择性 ［８９］ 流（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘ）。自噬在生命体的绝大多数细胞中 主要是通过选择性自噬来实现的 。选择性自噬过 都存在一个基础水平，以调节长寿命蛋白的周转和处 程中需要接头分子（也称为自噬受体），目前发现的这 理损伤的细胞结构，在饥饿、雷帕霉素等刺激因素下， 类接头主要有ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１、ＮＤＰ５２、ＮＢＲ１、Ｎｉｘ等。接 自噬水平会激发到一个比较高的水平，而在巴佛洛霉 头分子一般都含有ＬＣ３相互作用结构域和泛素结合结 素 ［２］ 构域，通过ＬＣ３相互作用结构域与ＬＣ３相互作用，在自 Ａ１存在的条件下，自噬流会被抑制 。大量研究已 经表明，细胞自噬在真核生物的生长发育、各种生理和 噬体形成过程中被自噬体包裹，最终通过溶酶体降解， 病理变化中发挥着重要作用，在机体各种疾病的发生 其泛素结合结构域结合的目标分子也被溶酶体降解。 ［１２］ 由于这类接头分子的细胞内含量受到自噬水平的明显 发展中起着重要作用 。虽然目前对自噬发生的过 ［３６］ 调控，因而接头分子在细胞内的蛋白质水平可以反映 程和机制有了较深入的认识 ，但是对自噬过程中的 很多细节依然缺乏足够了解，如自噬体膜来源、自噬体 细胞内的自噬流。这类接头分子中研究得最多的是 ＳＱＳＴＭ１蛋白，它在细胞内的水平已经被证明受到细胞 收稿日期