细菌总数与大肠菌群数测定.ppt

* * * * * * * * * * 大肠菌群数测定 实验步骤： 1.初发酵 （1）2个大试管（内有倒管），100ml水样+已灭菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（50ml） （2）10支试管（内有倒管），10ml水样+已灭菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（5ml） （3）培养：37 ℃，24h （4）观察指标： 产酸（黄色），产气（倒管内有气泡） 吸取水样 加注水样 初发酵结果 左2为阳性结果，培养基变成黄色（产酸），小倒管内有气体产生。 大肠菌群数测定 实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 37℃，24h 分离培养 器材与试剂 初发酵结果、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基 分区划线法 第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环 分区划线法 操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动 大肠菌群数测定 实验步骤 2.分离培养：  （5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检：选特征菌落 革兰染色法 器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸 革兰染色法 涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀 热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 复染：复红一滴，30s 涂片 热固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏染色阴性 革兰氏染色阳性 革兰染色法 复发酵 器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管 大肠菌群数测定 实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气 液体接种 复发酵 复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生 根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表，报告每升水中的大肠菌群数 MPN法原理 MPN法（Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值 MPN法原理 MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x ×xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为： 其中C为常系数 V为总水样量，x为细菌个数 MPN法原理 3.当y(x)?max，X?MPN 4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即 5.解此方程，得x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261页。 * * * * * * 主要内容 细菌总数测定 总大肠菌群测定 第一部分 细菌总数的测定 测定方法、方法依据以及测定范围 测定原理 检测试剂、仪器设备 分析步骤 结果计算 注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识 ? 一、?测定方法：平皿计数法 二、 方法依据：《生活饮用水卫生规范》（2001） 三、?测定范围 ：水中的细菌总数的测定 四、?测定原理 细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异样菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落可能要低于真正存活的细菌总数。 五、试剂 营养琼脂 （1）成