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壳聚糖季铵盐抗植物病原真菌活性探究 　　摘要：以2，3-环氧丙基三甲基氯化铵（EPTAC）作为改性剂成功合成了具有良好水溶性的壳聚糖季铵盐（HTCC）；通过傅立叶红外图谱（FT-IR）、氢核磁共振（1H NMR）对其进行了结构表征；研究HTCC在不同浓度、pH、金属离子条件下对花生尾孢菌（Cercospora arachidicola）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana）、可可刺盘孢（Colletotrichum coccodes）4种植物病原真菌的抗菌活性；对其抗真菌机理进行了初探。结果表明，2.0 mg/mL的 HTCC对花生尾孢菌、苹果轮纹病菌的抑菌率达74.8%和71.8%；pH是影响抗菌活性的一个重要因素；除苹果轮纹病菌外，HTCC对其他病菌的抑菌率在加入金属离子后均增加，Mg2+、Ca2+的加入使抑菌率达100%；HTCC处理能引起菌丝体蛋白质和核酸外泄。 关键词：壳聚糖；壳聚糖季铵盐（HTCC）；抗真菌活性；机理 中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3306-04 随人们对食品安全和环境安全的重视，开发新型无毒无害的农用抗菌剂成为当前研究热点之一。壳聚糖（CTS）作为一种绿色环保抗菌剂而受到国内外持续关注和研究。壳聚糖是自然界中惟一的碱性多糖[1]，不仅来源丰富，而且具有安全无毒、生物相容性好、可生物降解、防腐抗菌[2]、无免疫源性[3]等生物学性能和制粒、拉丝、成膜[4]、吸湿保湿[5]等理化特性，被广泛应用于医药、化工、农业以及生物工程等领域[6]。但是，壳聚糖不溶于水的性质限制了其进一步应用。试验通过烷基化改性壳聚糖制得了水溶性的壳聚糖季铵盐（HTCC），采用傅立叶红外图谱（FT-IR）、氢核磁共振（1H NMR）对其结构进行表征；选取花生尾孢菌（Cercospora arachidicola）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana）、可可刺盘孢（Colletotrichum coccodes）4种农作物易感病原真菌作为测试菌种，研究了不同浓度、pH、金属离子条件下壳聚糖季铵盐的抗真菌性能，并初步探索其抗菌机理。 1 材料与方法 1.1 试剂 壳聚糖（脱乙酰度90%），购自天津市久康生物工程有限公司；2，3-环氧丙基三甲基氯化铵（EPTAC），购自上海笛柏化学品技术有限公司；异丙醇、乙醇、醋酸等试剂均为市售分析纯，水为双蒸水。 1.2 菌种 花生尾孢菌、立枯丝核菌、苹果轮纹病菌、可可刺盘孢，河北工业大学化工学院生物工程系保藏。 1.3 HTCC的合成与表征 6 g壳聚糖（粘均相对分子质量为2×104）加入到54 mL异丙醇中，搅拌均匀，水浴加热至60 ℃，加入60 mL 370 mg/mL 的EPTAC溶液，水浴升温至80 ℃，反应10 h，离心、弃上清液，沉淀经80%异丙醇洗涤，离心，取沉淀冻干即为HTCC。HTCC用KBr压片，使用TENSOR 27型红外光谱仪（德国Bruker Optics公司）对HTCC进行红外光谱分析；使用AVANCE 400型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker Biospin公司）对HTCC进行氢核磁共振分析。 1.4 HTCC抗植物病原真菌活性测定 1.4.1 不同浓度HTCC抗真菌活性的分析 PDA培养基中加入HTCC醋酸缓冲液（pH 5.0），使培养基中HTCC终浓度依次为0.0（对照，CK）、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。培养基中央贴直径6 mm的菌饼，27 ℃培养，定时测量菌落直径，计算抑菌率（IR）。 1.4.2 pH对HTCC抗真菌活性的影响 配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0的 HTCC终浓度为0.5 mg/mL的PDA培养基，贴菌饼培养5 d，测定抑菌率。以不加HTCC的相同pH的PDA培养基为对照（CK）。 1.4.3 金属离子对HTCC抗真菌活性的影响 PDA培养基中分别加入HTCC醋酸缓冲液（pH 5.0）和K+、Na+、Ca2+、Mg2+金属离子，使金属离子终浓度为1 mmol/mL，HTCC终浓度为0.2 mg/mL。贴菌饼培养7 d，测定菌落直径，计算抑菌率。 1.4.4 抑菌率计算 抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径） × 100%。 1.5 HTCC抗植物病原真菌机理研究 取液体培养3 d的C. arachidicola菌丝4 g（湿重），用0.9%的NaCl溶液洗涤，悬浮于40