转基因小鼠模型的建立(SOP).PDFVIP

中国试剂网 3.28.3.2 转基因小鼠模型的建立(SOP) 名称：转基因小鼠模型的建立(SOP) 关键词：转基因小鼠 目的：在动物体研究转化基因 原理： 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整 合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动 物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、 供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 当制备转基因动物时，外源基因可能只整合到动物的部分组织细胞的基因组，也 可能整合进动物所有组织细胞的基因组中。部分组织细胞的基因组中整合有外源 基因的动物，称为嵌合体动物。此类动物中，只有外源基因整合的“部分组织细 胞”恰为生殖细胞时，转基因才具有遗传性状，否则，外源基因将不能传给子代。 转基因的方法多样，有胚胎干细胞法、逆转录病毒载体法，显微注射法等，此章 介绍显微注射法制备转基因小鼠。此法获得转基因动物的数量较多。 （一）显微注射法的基本原理和方法 转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射 法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞) ，然后将此受精卵(或着床前胚胎细 胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫) 中，使其发育成携带有外源基因的转基因动 物，通过分析转基因和实验小鼠表型的关系，研究揭示外源基因的功能，而且可 进行工程动物的大量生产。 Gorden 等报道了显微注射法用于转基因小鼠的制备。本法是最早，且应用成功 率较高的一种转基因方法。其基本步骤如下： 1．同步获得供体雌鼠（注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得）和假孕受体母鼠 （正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生) 。 2 ．供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵。 3. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。 4. 受精卵鉴定 ，将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输 卵管(或子宫) 内，饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。 中国试剂网 3.28.3.2 5. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。 6. 转基因小鼠品系的建立。 [优点] （1）外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高； （2 ）此法导入外源基因无需载体； （3 ）转基因小鼠得率在60%-80% ； （4 ）导入的外源基因可长达50kb 。 [不足之处] （1）外源基因随机整合； （2 ）个别原核不清晰，需进行特殊处理； （3 ）需大型精密仪器，费用昂贵； （4 ）操作周期相对较长。 （二）实验器材的准备 1．输精管切除术用器材：弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、自动小 夹涂药器、自动小夹、带弯针4/0 丝线及持针器、直径为10cm 塑料 Petri 氏 培养皿（内盛70%乙醇）。 2 ．手术前麻醉 2 ，2 ，2 三溴乙醇（阿佛丁）是相当有效的麻醉剂。因该试剂对光敏感，所以应 该于4 度避光保存，新试剂用前应进行测试。经腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后， 为了使麻醉剂尽快发生作用，将小鼠放回原笼熟悉的环境中，小鼠将会更容易松 驰下来。 挤压小鼠脚垫，如果小鼠能感觉到此刺激，小鼠将从挤压部位开始缩 腿运动（pedal reflex ），用此方法可以检察是否麻醉完全。实验中小鼠无缩腿运 动、小鼠达到手术所需的麻醉深度以及程度方可开始手术。 三溴乙醇的反复使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎症反应。其他麻醉剂中，克 他命/ 甲苯噻嗪在兽医界广泛应用，另外，克他命/美托咪定也越来越受到青睐， 特别是在美国。我国一些实验室用戊巴比妥钠的效果好,特别是尾静脉注射控制 很方便.30g 左右小鼠用0.85% 的戊巴比妥钠0.3ml 左右。 3 ．受精卵的采集用器材：70%乙醇、手术剪、10mL 解剖剪、手术镊、M2 溶液 （Sigma）、小玻璃皿等。 中国试剂网 3.28.3.2 4 ．离体输卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科镊子、5 号镊子、 无菌30-mm 组织培养皿、解剖显微镜、透明质酸酶、移液管、工作液、M16 溶 液（Sigma）、3