洛伐他汀联合厄贝沙坦对梗阻性肾病大鼠骨桥蛋白和肾间质纤维化影响.docVIP

洛伐他汀联合厄贝沙坦对梗阻性肾病大鼠骨桥蛋白和肾间质纤维化影响 　　[摘要] 目的 探讨洛伐他汀联合厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠骨桥蛋白（OPN）表达及肾间质纤维化的影响。 方法 将试验用SD大鼠随机分为4组（n = 10）：假手术对照组、单侧输尿管结扎组（UUO组）、厄贝沙坦组（60 mg/L）、联合治疗组（洛伐他汀20 mg/L联合厄贝沙坦60 mg/L）。对照组及模型组仅予等量生理盐水灌胃。观察各组大鼠第6周肾功能、24 h尿蛋白和肾组织病理学改变，并检测肾组织骨桥蛋白的表达。 结果 与模型组比较，厄贝沙坦治疗能使OPN的表达降低（P 　　1 材料与方法 1.1 动物与分组 40只SD雄性大鼠，许可合格证号SCXK（渝）2007-0005，体质量170～220 g，由重庆实验动物中心提供，按数字随机法分为4组：假手术对照组（n = 10）、UUO组（n = 10）、厄贝沙坦组（60 mg/L，n = 10）、联合治疗组（洛伐他汀20 mg/L联合厄贝沙坦60 mg/L，n = 10）。术前2 d开始给药，对照组及模型组仅予等量生理盐水灌胃。 1.2 动物处理 单侧输尿管结扎手术后2周麻醉后从颈总动脉采血，离心分离血清，用于测定尿素氮、血清肌酐（Scr）。同时脱髓处死所有大鼠，剖取左侧肾脏，剥离包膜，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，行HE和Masson染色，其他切片用于免疫组织化学。 1.3 大鼠尿蛋白和肾功能的检测 处死大鼠前1 d，将大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，用邻苯三酚红钼络合法测定24 h尿蛋白量。麻醉后处死大鼠时经心脏取血2 ml，用全自动生化分析仪测定Scr。 1.4 肾脏病理改变及肾间质面积 抽取血液后，迅速将残肾取出，肾组织以10%甲醛固定并编号，石蜡包被，2 μm厚连续切片，Masson染色，光镜下观察。200倍光镜下每个标本选取选 10个肾小管间质视野（避开肾小球和大血管），每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。采用显微图象分析系统（Olympus C3040-ADU）对各组染色结果进行积分光密度（IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视野（200倍），每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD值，取平均值。 1.5 免疫组织化学法检测OPN的表达 2 μm的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，滴加3%H2O2：去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗，加入适当比例稀释的一抗50∶1，37℃孵育1 h。加入二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，增敏二氨基联苯胺（DAB）显色。镜下观察染色情况，蒸馏水及时终止反应，自来水冲洗5 min。苏木素淡染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用PBS代替一抗作为阴性对照。阳性反应物部位呈棕色，细胞核呈淡蓝色。在400倍的显微镜视野下，每张切片于皮髓质交界处随机取5个不重复视野的肾小球，由摄像系统提取数据化病理图像，输入图像分析系统Motic Images Advanced进行吸光度（A）值计算，取其平均A值进行统计分析。 1.6 统计学处理 采用统计软件SPSS 13.0进行数据分析，实验数据计量资料用均数±标准差（x±s）表示，均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，检验水准为0.05。 2 结果 2.1 洛伐他汀联合厄贝沙坦治疗对UUO模型大鼠肾功能及肾间质面积的影响 UUO组24 h尿蛋白量、Scr及肾间质纤维化面积均显著高于假手术对照组（P 　　近年来随着对他汀类药物的深入研究，已认识到他汀类药物除调节血脂作用外，还具有更重要的抗细胞增殖、抗炎症[13]、免疫调节[14]等非依赖调脂的肾脏保护作用，最新研究报道其亦可促进肝脏肌成纤维细胞的衰老，从而减弱纤维化的进展[15]。因此，在应用厄贝沙坦干预治疗UUO大鼠模型的基础上，本研究加用了他汀类药物，发现肾小管间质OPN蛋白的表达进一步减少，小管间质纤维化得到更为显著的改善，甚至一定程度上阻断了纤维化的进程，为临床治疗梗阻性肾病提供了新的依据。 [参考文献] [1] Nasu T，Kinomura M，Tanabe K，et al.Sustained-release prostacyclin analog ONO-1301 ameliorates tubulointerstitial alterations in a mouse obstructive nephropathy model[J].Am J Physiol Renal Physiol，2012，302（12）：F1616-F1629. [2] Alexopou