生物工程下游技术32微生物细胞破碎2009.ppt

细胞破碎的必要性 细胞壁的组成与结构 微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键。 外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等。 破碎程度的评价 破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y（%）=[（N0-N）/N0]*100 其中N0——原始细胞数量； N ——经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。 N0和N的确定方法： 直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。 细胞破碎技术 常用的破壁方法 常用的破壁方法——珠磨法 作用机理：固体剪切作用 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。 此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。 一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm较好，工业规模不得小于0.4mm。 不同的细胞类别及所需提取的酶在细胞中的位置等也是应考虑的因素。 有研究表明，减小磨珠直径起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。 eg.从酵母细胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如1mm直径）磨珠。 在一定范围内，增加珠体装填量可以提高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。 为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。 一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-90%，并随珠体大小变化。 细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用Netzsch LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制在40%左右。 Currie等人的研究表明，操作温度控制在5-400C范围内对破碎物的影响较小。 常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨室的温度。 常用的破壁方法——高压匀浆 作用机理：液体剪切作用 此方法中影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由500C提高到300C，破碎率约提高1.5倍。 常用的破壁方法——超声波破碎 超声波振动在液体中传播的音波压强达到1atm时，功率密度为0.35 w/cm2，这时超声波的音波压强峰值可达真空或负压，但实际上无负压存在，因此在液体中产生一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非常接近真空，在超声波压强反向达到最大时破裂。 振幅 细胞悬浮液的黏度 表面张力 被处理悬浮液的体积 珠粒的体积和直径 探头的形状和材料 细胞悬浮液的流速 常用的破壁方法——酶溶法 常用酶： 溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、 β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等。 在某些情况下，不加外源酶也可使某些微生物发生自溶。 eg.谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌） 加入pH10的缓冲液（0.028mol/LNa2CO3— 0.018mol/LNaHCO3 ），配3%的细胞悬浮液，加热至700C，保温搅拌20min，菌体即自溶。 常用的破壁方法——化学渗透法 所用的化学试剂：酸、碱、表面活性剂、脂溶性有机溶剂、EDTA鳌合剂、变性剂等。 酸、碱：用来调节溶液的pH值，改变细胞所处环境，改变蛋白质的电荷性。 有机溶剂：常用的是甲苯，被细胞壁脂质层吸收后导致胞壁膨胀，造成细胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。 表面活性剂：天然的如胆酸盐、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。 变性剂：如盐酸胍，与水中氢键作用，消弱溶质分子间的疏水作用。 eg.1. 某些动物细胞（肿瘤细胞）可采用SDS、