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羽衣甘蓝DH1代株系遗传稳定性研究 　　摘要：以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）两个自交系（F6代）作比较，利用ISSR标记技术检测了羽衣甘蓝3个DH1代株系的遗传稳定性，并对5个群体进行聚类分析。结果表明，3个DH1代株系DN31、DP70、DT2和两个自交系B62、B111利用9条ISSR引物分别扩增出55、51、50、54和51条清晰条带，其中，多态性位点DN31有3个，DP70有2个，DT2没有，B62有19个，B111有15个。羽衣甘蓝DH1代株系内基本不存在遗传差异，基因型是纯合的，两个自交系遗传稳定性相对较差。表明小孢子培养技术在获得纯合体材料上比人工自交的方法高效、快捷，而且获得的纯系基因型更纯、更稳定。 关键词：羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）；DH系；ISSR标记；遗传稳定性；聚类分析 中图分类号：S635.9；S503 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3056-03 利用小孢子培养技术能快速获得育种急需的遗传稳定材料和培育新的种质资源，提高育种效率。小孢子培养所得植株加倍后获得的双单倍体构成的群体称为DH群体，从DH群体中筛选出来的株系叫DH系，DH系在遗传上是完全纯合的，可以直接作为优良亲本用于品种改良[1]。科研工作者采用小孢子培养技术已获得一系列作物的优良品系[2-4]。ISSR分子标记具有DNA样品用量少、操作简单、信息量大、多态性高等优点，且由于引物更长，退火温度更高因而具有更好的可重复性和稳定性[5]，是分析种质遗传多样性和亲缘关系的有效工具。很多研究均成功地利用ISSR标记技术分析植物的遗传变异性和遗传关系[6-8]。 羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）是十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）甘蓝种的一个变种，二年生草本植物，观叶为主，由于耐寒性强，观赏期长，已成为我国广大地区冬季及早春时节应用最广泛的观赏植物之一[9]。利用游离小孢子培养技术开展羽衣甘蓝育种工作，能快速获得育种急需的遗传稳定材料，提高育种效率。小孢子植株DH系基因型理论上是完全纯合的，而通过多代自交也可以达到此目的。为了比较小孢子培养技术和人工自交分别获得纯合体材料的效率，试验以羽衣甘蓝两个自交系作比较，利用ISSR标记技术检测了羽衣甘蓝3个基因型DH1代株系的遗传稳定性，并对5个株系进行了聚类分析。 1 材料与方法 1.1 材料 羽衣甘蓝3个基因型名古屋-红、P3、东京-白的DH1代DN31、DP70和DT2，名古屋-红和“K12”的自交系B62（F6代）和B111（F6代），材料来源及主要特征见表1。由羽衣甘蓝小孢子培养获得的植株称为DH0代，经DH0代自交的自交一代称为DH1代。 1.2 方法 1.2.1 DNA的提取 分别从供试材料各单株上取幼嫩叶片，参照王灏等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因组DNA。 1.2.2 ISSR扩增 ISSR引物自行设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系20 μL，其中10×Buffer 2 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 20 ng。 扩增反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃复性45 s，72 ℃延伸90 s，接着梯度降温进行复性，5个循环后稳定在53 ℃复性，进行38个循环；最后72 ℃延伸10 min，扩增产物在4 ℃保存。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶（TAE电泳缓冲液，0.5 μg/L溴化乙锭）电泳检测。在凝胶成像系统上观察、拍照鉴定。 1.2.3 数据分析 ISSR电泳结果采取0/1赋值记带，有带记为1，无带记为0。对原始矩阵用SimQual程序求Jaccard相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。利用PopGene 32软件计算扩增产物的多态性位点数（the number of polymorphic loci，N）、多态性位点比率（the percentage of polymorphic loci，P）、Shannon多样性指数。用NTSYS-pc 2.10e软件进行数据分析，将由“1”和“0”生成的原始矩阵用UPGMA方法进行聚类分析，最后通过Tree plot模块生成聚类图。 2 结果与分析 2.1 羽衣甘蓝DH1代株系ISSR标记扩增产物的多态性 从38个ISSR引物中选取9个能够获得清晰条带、反应稳定的ISSR引物（表2）。DN31、D