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苦马豆素人工抗原免疫小鼠安全性试验 　　摘要：通过分析苦马豆素（Swainsonine，SW）人工抗原SW-OVA对小鼠机体的影响，进行安全性评价。将36只昆明种小鼠随机分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组，每组12只。试验组依次进行首免和加强免疫，免疫前采血，分析血清生化指标谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-甘露糖苷酶（AMA）、尿素氮（BUN）的变化，血常规指标红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、淋巴细胞数（LYM）、血小板数（PLT）和血红蛋白含量（HGB）的变化，同时检测免疫组血清中有无SW，并观察小鼠脏器系数及其形态学变化。结果表明，免疫组小鼠与对照组小鼠血清生化指标、血常规指标和脏器系数差异不大，免疫小鼠血清中未检出SW，镜检未见免疫小鼠器官出现中毒现象。合成的人工抗原SW-OVA具有较好的安全性。 关键词：苦马豆素（Swainsonine，SW）；人工抗原；免疫；小鼠 中图分类号：S852.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3370-03 苦马豆素（Swainsonine，SW）是豆科棘豆属（Oxytropis）和黄芪属（Astragalas）等疯草植物的主要有毒成分[1]。疯草在中国分布广泛，目前对疯草蔓延采取的防除方法主要有人工挖除、化学药剂灭除等。其中人工挖除仅适用于小面积草场，而且效果并不理想；化学药剂灭除极易造成环境污染，不利于畜牧业的可持续发展[2]。疯草为豆科植物，营养成分较为全面[3]。 目前利用免疫预防的方法使家畜安全利用疯草，已经成为了国内研究的热点[4]。SW分子量小，属于半抗原，不具有免疫原性。需要将SW与大分子载体蛋白偶联合成人工抗原，将合成的人工抗原用于动物免疫，即可诱导动物机体产生抗SW的特异性抗体，使动物获得对疯草的免疫力。但合成的人工抗原有可能在机体降解释放出SW，故需要对其进行安全性评估。本试验用人工合成抗原SW-卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）免疫昆明种小鼠，通过分析血清生化指标、血常规指标和脏器系数，检测SW-OVA对免疫小鼠机体的影响，并监测小鼠血液中有无SW，以探讨SW-OVA对动物机体的影响，为抗SW单克隆抗体的制备奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 昆明种小鼠36只，雌雄各半，体重（22±2）g，购自塔里木大学动物科学学院实验站。 1.2 试剂与仪器 SW-OVA由新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室制备；弗氏完全佐剂（FAC）、弗氏不完全佐剂（FAI）购自Sigma公司；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、尿素氮（BUN）、α-甘露糖苷酶（AMA）检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；其余常规试剂均为国产分析纯。 Carry 100型紫外-可见分光光度计（无锡天牧仪器科技有限公司）；DK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；BS124型精密电子天平（德国赛多力斯）；VetTest 8008型生化分析仪、StatSpin VT型离心机（北京安普生化科技有限公司）；Direct-Q3型超纯水系统（美国Millipore）。 1.3 抗原的制备 按不同免疫剂量精确称取SW-OVA溶解于一定体积的生理盐水中，加入等量佐剂混匀，至完全形成白色油包水型乳浊液，小鼠注射剂量为0.2 mL。首免时佐剂使用FAC，第一次和第二次加强免疫佐剂使用FAI，第三次加强免疫不使用佐剂，完全使用生理盐水溶解。 1.4 小鼠免疫试验 参考王帅等[5]的研究进行免疫试验，对各免疫组使用FAC进行基础免疫，再以相同免疫途径进行首免和加强免疫。各免疫组免疫剂量和免疫时间见表1。对照组每次注射等体积的抗原乳化液。 1.5 血样采集及血液指标测定 在每次免疫的当天早晨对每组随机取3只小鼠，眼眶取血。当日下午进行免疫操作，共采血4次。采回的全血3 000 r/min分离血清，进行临床生化指标测定。血清检测的指标有：谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、α-甘露糖苷酶（AMA）、尿素氮（BUN）。抗凝血用于测定血常规指标：红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、淋巴细胞数（LYM）、血小板数（PLT）和血红蛋白含量（HGB）。 1.6 免疫小鼠血清中SW的定性检测 参考宋毓民等[6]的研究对血清进行前处理，采用薄层层析（TLC）检查是否含有SW。TLC条件参照文献[7]，若薄层板Rf为0.48左右处出现紫红色斑点则判定为检测到SW，否则判定检液不含SW。 1.7 试验小鼠脏器