高效液相色谱法检测鱼肉组织中金霉素、多西环素、米诺环素残留.docVIP

高效液相色谱法检测鱼肉组织中金霉素、多西环素、米诺环素残留 　　摘要：建立了鱼肉组织中金霉素、多西环素、米诺环素的多残留检测的高效液相色谱法（HPLC）。样品经0.1 mol/LEDTA-McIlvaine缓冲液（pH 4.0）提取离心后，上清液用Oasis HLB固相萃取小柱净化，选用安捷伦Eclipse plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，粒径5μm），以乙腈：甲醇：0.01 mol/L草酸溶液（2﹕1﹕7）为流动相，流速0.5 mL/min，350 nm波长处测定，外标法定量。其3种药物浓度在25～200 ng/mL时均与峰面积呈良好的线性关系。结果表明，3种目标物质在鱼肉组织中的检测限为25 μg/kg，定量限为50 μg/kg。在不同浓度添加水平下测定，平均回收率在76.5%～89.1%，批内、批间变异系数均在10.00%以内。 关键词：金霉素；多西环素；米诺环素；多残留；高效液相色谱法（HPLC） 中图分类号：TS254.7 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）06-0017-05 四环素类（Tetracyclines，TCs）药物是由放线菌产生的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有很好的抑菌作用，常被用于畜、禽和水产养殖中[1]。目前国内四环素类抗生素主要包括六种：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素（多西环素）、美他环素和米诺环素。 本文针对3种四环素类抗生素药物的特性，研究其在鱼肉中的多残留检测方法。方法采用高效液相色谱法，其具有选择性高、分离效果好、检测灵敏度高等优点，其准确度和回收率均能满足国家规定的对四环素类药物残留限量的要求，具有较好的通用性和推广性。 1 材料与方法 1.1 仪器与设备 Waters2695高效液相色谱仪 （配2487型紫外检测器）；分析天平；回旋振荡器；旋涡混合器；数显恒温水浴锅；高速冷冻离心机；氮吹仪；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL） 1.2 药品与试剂 金霉素（CTC）、多西环素（DC）、米诺环素（MINO）标准品含量均大于80.0%。草酸、无水磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四醋酸二钠均为分析纯；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为重蒸馏水。 1.3 溶液的配制 标准储备液的配制：分别精密称取金霉素、多西环素、米诺环素的标准品10.00 mg，用适量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，配成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，置于0 ℃冰箱中冷藏避光保存。保存期为1个月。 混合标准工作液的配制：用流动相稀释成适当浓度的标准工作液，现配现用。 0.01 mol/L草酸水溶液的配制：称取草酸1.26 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。 0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.0）的配制：称取无水磷酸氢二钠28.4 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。称取柠檬酸21.0 g，加水溶解，稀释到1 000mL。将上述磷酸氢二钠溶液625 mL和柠檬酸溶液1 000mL混合，加入乙二胺四醋酸二钠60.5 g，使其溶解，摇匀。必要时，用0.1 mol/L盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.0±0.05。 洗脱液（0.01 mol/L草酸-甲醇溶液）的配制：称取草酸1.26 g，加甲醇溶解，稀释到1 000 mL。 1.4 试验方法 1.4.1 色谱条件 色谱柱∶ 安捷伦Eclipse plus C18：250 mm×4.6 mm，粒径5 μm；流动相∶乙腈∶甲醇∶ 0.01mol/L草酸溶液（用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至2.5）=2∶1∶7；流速：0.5 mL/min；进样量：50 μL；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm。 1.4.2 标准曲线的绘制 准确量取适量的标准储备液，用流动相分别稀释成25、50 、100 、200 、500 、1 000 ng/mL的标准工作液，供仪器分析，每个浓度重复检测两次，取其平均峰面积值为纵坐标，再分别以金霉素、多西环素和米诺环素的浓度为横坐标，绘制标准曲线，拟合，求标准曲线方程和相关系数。 1.4.3 样品的提取和净化 称取（5.00 ±0.05）g试样，置于50 mL塑料离心管中，加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH 4.0）15 mL，涡旋混匀1 min，用回旋振荡器振荡20 min后，15 ℃，6 000 r/min离心10 min，上清液转移到另一洁净50 mL塑料离心管中，在残渣中再加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液10 mL重复