亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽探究中应用.docVIP

亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽探究中应用 　　摘要 蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用。由于技术条件的限制，传统的糖蛋白分析方法中，通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构，而忽略了蛋白质与糖链的连接关系。本研究旨在以完整糖肽作为检测对象，对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析。采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化，联合生物质谱中碰撞诱导解离（CID）、高能诱导解离（HCD）、电子转移解离（ETD）等裂解模式，对完整糖肽的糖基化位点、糖链结构、肽段序列等进行全方面的解析。结果表明，亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽，采用30% CID能量，主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；采用25% HCD能量，在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式，为完整糖肽的结构解析提供了一种快速、有效的研究方案。 关键词 亲水作用色谱； 串联质谱； 完整糖肽； 碰撞诱导解离； 高能诱导解离； 电子转移解离 1引言 蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1，2]，但其研究面临很多挑战。糖基化修饰具有多样性。糖基化修饰没有任何模板[3]，而是由200多种糖基转移酶调控，同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一，同一位点所携带的糖链也存在多种结构，这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战；目前完整糖肽的分析手段有限，主要以质谱分析为主，但由于糖肽修饰的微不均一性，及在质谱中离子化困难、碎裂情况复杂等特点，严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展。 2012年，Doerr等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段，并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放，然后分别对两者进行解析，这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失。聚糖结构解析[5]，可以解析大量糖链结构，却忽视了糖链的来源；蛋白部分研究[6]，可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点，却丢失了糖链信息。Nakano等[7]研究发现，特异位点的糖基化修饰影响生物学功能，这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义。因此，开发完整糖肽水平的研究方法，保留蛋白质与聚糖之间的连接，已成为当前的研究热点。 完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约，需要从富集和鉴定两方面解决。首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平，及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题。可以通过完整糖肽的富集与分离，去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度。目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]、二氧化钛[9]、酰肼[10]和亲水相互作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）[11]等。其中，HILIC是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性，而使糖肽与非糖基化肽段得以分离。HILIC对不同类型的糖肽没有偏性，且能保持糖链结构的完整性，适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术。其次，完整糖肽包含肽段和糖链两部分，其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱中的碎裂行为有较大的区别，仅采用经典的碰撞诱导解离（Collisioninduced dissociation， CID）碎裂不能有效得到糖肽的全面信息，Wiesner等[12]指出， 电子转移解离（Electron transfer dissociation， ETD）碎裂模式在蛋白质翻译后修饰研究中， 可以补充CID的不足而发挥重要作用，高能诱导解离（High energy collisional dissociation， HCD）可以提供更为丰富的低分子段碎片离子信息。多种碎裂方式联合的方法在蛋白质组学中也已经得到有效应用[13]，多种碎裂方式联合应用的方式可以为完整糖肽研究提供借鉴。 本研究以完整糖肽作为检测对象，制作了HILIC富集装置，并联合CID， HCD， ETD等多种串联质谱碎裂方式，在解析糖链结构的同时，获取肽段序列以及糖基化位点信息，从而实现糖蛋白结构的全面解析。 2实验部分 2.1仪器、试剂与材料 基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪 （UltrafleXtremeMALDITOF/TOFMS， 德国 Bruker Daltonics公司）； 电喷雾电离线性离子阱静电场轨道阱质谱仪（ESILTQOrbitrapXL， 美国Thermo Fisher 公司）；离心机、冷冻干燥离心机（美国Thermo Fisher 公司）；HILIC 小柱