基因工程药物检定.ppt

（一）基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆 含干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达 （二）基因工程干扰素的制备 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装 1、原液检定 (1)效价测定用国家标准品校准确定效价(u) (2)蛋白质含量用Lowry法测定 (3)比活性应不低于1.0*107U/mg蛋白。 (4)纯度 wwwdocinGorti ①电泳法用非还原型SDS法。 ②高效液相色谱法用波长280mn检测 (5)相对分子质量用还原型SDS法 (6)外源性DNA残留量用固相斑点杂交法 (7) IgG残留量如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行本项检定；采用双抗体夹心酶联免疫法测定。 (8)宿主菌蛋白残留量用酶联免疫法测定。 (9)残余抗生素活性不应有残余氨苄青霉素活性 (10)细菌内毒素含量按2000版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》测定 (11)等电点为4.0-6.5，批与批之间等电点应一致 (12)紫外光谱扫描 (13)肽图(至少每半年测定1次)应符合干扰素odb的图形，或与对照品图形一致。 (14)N-末端氨基酸序列 (至少每年测定1次)用氨基酸序列分析仪测定。 2半成品检定 (1) 细菌内毒素含量按规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》测定； (2) 无菌试验按规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行 3成品检定 (1)鉴别试验用中和试验法 (2)外观应为白色薄壳状疏松体 (3)化学检定按2000版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行： pH值为6.5—7.5 水分应不高于3.0% (4)效价测定方法见附录，用国家标准品校准确定效价(U)； (5)无菌试验按2000版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行； (6)异常毒性试验按2000版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》小鼠试验项进行； (7)热原质试验按2000版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。 参考文献 郭俊清 ，徐进，李建正.基因工程药物研究概况[J].畜牧与饲料科学, 2011，32(7)：94-9. 胡文，陈惠鹏，汤仲明，等．生物制药的现状和未来(一)：历史与现实市场[J]．中国生物工程杂志，2004，24(12)：95-101． 吴晓英，范一文，周世水.生物药物分析与检验[M].第二版.北京：化学工业出版社，2011. 中国药典三部（2010版） * 内容提要 一、基因工程药物概述 1、含义： 基因工程药物是指将生物体内生理活性物质的基因分离纯化或者人工合成，利用重组ＤＮＡ技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞或转基因动物中大量表达，通过这种方法而生产的新型药物。 2、特点： 基因工程药物因其疗效好、应用范围广泛、副作用小的特点成为新药研究开发的新宠，也是发展最迅速和最活跃的领域。自1982年美国Lilly公司上市了第一个基因工程产品— — 人胰岛素以来，至今已有基因工程药物大约140多种上市，尚处于临床试验或申报阶段的基因工程药物有500多种。当传统制药业的增长速度减慢时，基因工程制药正在加速发展，全世界基因工程药物持续6年销售额增长率都在l5％～33％，基因工程制药已成为制药业的一个新亮点。 3、基因工程药物与一般药物比较 : ①它是利用活的细胞作为表达系统， 所获得的蛋白质产品往往相对分子