高效液相色谱同时检测蛋白饮料中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸前处理方法探究.docVIP

高效液相色谱同时检测蛋白饮料中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸前处理方法探究 　　【摘要】建立了二极管阵列─反相高效液相色谱同时快速测定蛋白饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸五种食品添加剂的检测技术。本文改进的前处理方法操作简便，试验精确度和准确度良好，非常适合应用在大量蛋白饮料样品的快速检测工作中。 【关键词】高效液相色谱；蛋白饮料；安赛蜜；苯甲酸；山梨酸；糖精钠；脱氢乙酸 在检测安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸等指标的前处理过程中，需要对提取液进行过滤，而蛋白饮料中蛋白质含量较高，影响过滤效率，是影响上述添加剂快速检测的主要环节。在水中，苯甲酸和山梨酸溶解度较低，按照GB/T23495采用亚铁氰化钾和醋酸锌进行蛋白质沉淀[1]后，苯甲酸和山梨酸与杂质一起沉淀，影响测定的准确性[2，3]。而按照GB/T21703调节pH值后，用亚铁氰化钾和醋酸锌沉淀蛋白质，再用甲醇定容[4]，则液相色谱图中组分峰出现拖尾现象，影响组分峰定量的准确性。因此有必要针对蛋白饮料的前处理方法进行改进，论证检验方法的实用性，使得数据准确可靠，操作更为简单，便于在基层常规检测工作中推广。 1、材料与方法 1.1仪器与试剂 1.1.1仪器 Waters e2695分离模块，Waters 2998 PDA检测器，超声清洗器。 1.1.2试剂 色谱纯甲醇，超纯水，0.5mol/L氢氧化钠，0.42mol/L 硫酸锌，0.02mol/L乙酸铵，1.00mg/mL苯甲酸、山梨酸、糖精钠（国家标准物质中心），配制250mg/L的安赛蜜储备液和110mg/L的脱氢乙酸储备液（北京上立方联合化工技术研究院）。 1.1.3色谱条件 色谱柱：TopsilTMC18（250mm×4.6mm×5μm）色谱柱，柱温：30℃，检测波长：230nm，流动相：甲醇：0.02mol/L的乙酸铵（8：92），流速：1.0mL/min，进样体积：20μL。 1.2前处理方法 称取1g蛋白饮料（精确至0.001g）于50mL比色管中，加入1mL NaOH溶液，摇匀，加入2mL有机沉淀剂，再分别加入1.5mL ZnSO4溶液、1.5mLNaOH溶液和5mL超纯水，超声处理后用超纯水定容至刻度，混匀，静置5min。上清液过滤（双层滤纸），滤液经0.45μm滤膜过滤后上机。 2、结果与分析 2.1样品前处理 蛋白饮料中蛋白质含量较高，在前处理过程中样品极难通过滤纸和滤膜，很大程度上影响了检测效率，因此需要采取有力措施除去蛋白质。因苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸在水中的溶解度较低，加入蛋白质沉淀剂后与杂质一起被沉淀，影响测定的准确性[2]，因此需要先将苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸转化为易溶于水的盐。另外，氢氧化钠有沉淀蛋白质的作用[5]，因此本文选择先用氢氧化钠促进苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸在水中的溶解。 由于硫酸锌和氢氧化钠对蛋白质的沉淀能力有限，考虑在不稀释样品的前提下，先加入硫酸锌和氢氧化钠并添加少量有机试剂使样液先进行蛋白质沉淀，再进行稀释和超声处理。我们选用常用的有机试剂甲醇、乙腈、丙酮、正己烷进行蛋白质沉淀试验，结果表明，经过改进的沉淀剂添加方法，能明显加强蛋白饮料中蛋白质的沉淀，当添加2mL甲醇、乙腈或丙酮时，与不加有机试剂相比，样液分层效果更佳。几种有机试剂相比，正己烷的分层效果最差。 从色谱图来看，加甲醇沉淀蛋白质，苯甲酸的峰出现拖尾现象，如图1所示。因为甲醇极性相对较大，使得检测样液极性与流动相极性差别加大，影响目标化合物在色谱柱中的分离，表现为峰拖尾现象。 图1 添加甲醇的样液中的混标色谱图 在同一蛋白饮料中，添加安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸的混合标样，样品定容后，这五种标准物质的浓度分别为：安赛蜜0.354mg/L、苯甲酸和糖精钠各0.200mg/L、山梨酸0.242mg/L、脱氢乙酸0.210mg/L。选取沉淀效果最好的丙酮和乙腈作为有机沉淀剂对样品前处理后，分别超声处理15min和30min，再进行上机测试，测试结果见表1。由表1，可知经丙酮和乙腈沉淀的样品，超声处理15min后，糖精钠和脱氢乙酸的回收率较低。考虑到前处理过程中添加剂分散不够均匀的可能，延长超声时间至30min，由测试结果可知，添加丙酮的样品中糖精钠和脱氢乙酸的回收率均有较大提升，而添加乙腈的样品中糖精钠和脱氢乙酸的回收率变化较小。因此，确定前处理过程中，以丙酮作为有机沉淀剂，超声处理时间为30min。 表1 不同前处理方法的各组分回收率 检测项目 回收率（%） 丙酮沉淀，超声15min 丙酮沉淀，超声30min 乙腈沉淀，超声15min 乙腈沉淀，超声30min