农杆菌介导ZmHSD1基因转化玉米自交系.doc

农杆菌介导ZmHSD1基因转化玉米自交系 　　摘要：以NPT Ⅱ基因为筛选标记，利用农杆菌转化系统将目的基因ZmHSD1转入玉米自交系昌7-2、齐319和18-599的胚性愈伤组织，筛选抗性愈伤，并获得再生植株。对再生植株基因组DNA进行PCR检测表明，ZmHSD1基因已经整合到玉米基因组中，并最终获得转基因T1代种子。 关键词：玉米；农杆菌；胚性愈伤组织；ZmHSD1基因 中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）07-0006-03 糖皮质激素是一类动物激素，参与糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢等过程，还具有抗炎的作用[1]。11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase， 11β-HSD）是调节糖皮质激素的关键酶，它促进活性糖皮质激素与非活性激素之间的相互转换[2，3]。虽然目前在植物中还没有鉴定出11β-HSD，但是随着拟南芥基因组测序工作的完成，发现了八个类似HSD的基因。最先鉴定出的是一种油菜籽HSD，它在利用ABA类似物抑制种子萌发的过程中过量表达[4]；Jolivet等[5]证实在芝麻和油料作物中只存在微量的HSD，这些HSD编码的蛋白表现出与NADP+所依赖的11β-HSD、17β-HSD/17β-类固醇脱氢酶相同的性能[6]。AtHSD1基因包括6个外显子和5个内含子，它编码的蛋白由389个氨基酸组成，李凤玲等[7]将AtHSD1的cDNA连接到35S启动子后整合到拟南芥中，发现转基因植株明显比野生株粗壮，其分支和长角果的数量也明显增多，转AtHSD1基因植株的表型与过量产生BR或过量表达BR受体基因BRI1的表型一致[8～10]；同时发现转基因植株的抗盐性比野生植株高[7]。因此，该基因在改善农作物植株生长、提高产量方面有很大的潜力。 本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法，尝试将ZmHSD1基因转入玉米自交系品种，以期获得转基因玉米植株，拓宽玉米种质的遗传背景，为高产稳产玉米品种的选育服务。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1植物材料玉米（Zea mays L.）自交系18-599、齐319和昌7-2。 1.1.2目的基因、载体、菌株ZmHSD1表达载体由山东农业大学生命科学学院基因工程实验室构建。表达载体中，目的基因为ZmHSD1，其启动子为Ubi；筛选标记基因为NPTⅡ，其启动子为CaMV35S（图1）。本研究所用质粒为PZP211，大肠杆菌菌株为DH5α，农杆菌菌株为LBA4404。 1.2试验方法 1.2.1培养基在N6改良培养基[11]的基础上，添加0.25 mg/L Na2MnO3、0.025 mg/L CuSO4·5H2O和0.025 mg/L CoCl2·6H2O。 1.2.2幼胚愈伤组织受体系统参照孙庆泉等[11]的方法，取幼胚接种于诱导培养基上，24～25℃暗培养，继代，选择诱Ⅱ型愈伤组织为转化受体。 1.2.3农杆菌介导的遗传转化 ①农杆菌的培养与活化：将低温保存的农杆菌菌种LBA4404接种到添加25 mg/L Spe的YEB固体培养基平板上，挑取单菌落接种于含25 mg/L Spe的 YEB液体培养基中，置于摇床上预活化（28℃，200 r/min），取预活化的菌液培养至对数生长期备用。 ②愈伤组织浸染：浸染前将新培养的菌液离心沉淀菌体，用液体N6培养基重悬，并稀释到所需OD值。将Ⅱ型愈伤组织分离成米粒大小的小块，投放到稀释好的菌液中浸染。用灭菌的滤纸吸干愈伤表面的菌液，并将其摆放到共培养培养基上暗培养3 d，用头孢水洗菌。将洗好的愈伤放到恢复培养基上恢复培养。 ③抗性愈伤的筛选、分化和再生：恢复培养后的愈伤组织依次转移到1次、2次、3次筛选培养基上，进行抗性筛选，筛选剂为巴龙霉素。将筛选后存活的愈伤转到分化培养基上分化成苗。分化苗苗高4～5 cm时转到生根壮苗培养基上。当苗适度生根后转到基质（基质∶蛭石=1∶1）中。成活植株转到大田隔离区。 1.2.4转基因植株的PCR检测CTAB法提取基因组DNA。对转化植株、阳性对照（质粒）和阴性对照（未转化植株）进行PCR检测，检测对象为目的基因ZmHSD1和标记基因NPTⅡ。根据已知的ZmHSD1基因序列，利用primer premier 5.0软件设计ZmHSD1的引物，上游引物在启动子内部，下游引物在编码区内，S： CACGATTCTTCCTCGGCTCCTCT， A： TGCTACTCCTTCCTTTCCTGGCT；标记基因NPTⅡ的引物为S： GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG，A： AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC。