农杆菌介导马铃薯块茎GUS基因瞬时表达探究.doc

农杆菌介导马铃薯块茎GUS基因瞬时表达探究 　　摘 要：采用根癌农杆菌介导的瞬时表达方法，以马铃薯块茎为主要的研究材料，分别采用浸染法和注射法将外源基因导入马铃薯块茎细胞中，然后进行GUS组织化学染色。试验结果表明，导入马铃薯块茎细胞里的外源基因获得了表达；浸染法的表达区域更加均匀，优于注射法。 关键词：马铃薯；块茎；根癌农杆菌；瞬时表达；GUS 中图分类号：S532 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.11.001 马铃薯（Solanum tuberosum L.）俗称“土豆”，是茄科茄属多年生草本块茎植物，原产于安第斯山区和智利沿海山地，是仅次于水稻、玉米、小麦的世界第四大重要粮食作物，具有分布广泛、高产稳定、适应性强、营养丰富等特点，是一种兼具粮食、蔬菜、饲料以及工业原料等具有多种用途的经济作物[1]。 目前，农杆菌介导的瞬时表达方法已经在烟草、拟南芥、莴苣、番茄、草莓、梨等多种植物中得到应用。利用此方法在叶片和果实中进行的研究比较常见，但是没有发现利用农杆菌介导法对马铃薯块茎进行瞬时表达的研究报道。传统的稳定转化方法是目前研究马铃薯块茎最常用的方法，但是其具有试验周期长、耗资大、表达效率低下等缺点，因此，农杆菌介导的瞬时表达方法在马铃薯块茎上可以得到应用，将使得对马铃薯块茎特异启动子的研究变得更加方便快捷。 刘敏等[2]和孟楠等[3]采用注射法对草莓果实进行瞬时表达均获得成功，但是相对于草莓果实而言，马铃薯块茎结构更加致密，给试验带来了困难。本研究分别采用浸染法和注射法侵染马铃薯块茎，以马铃薯叶片及烟草叶片为对照，通过GUS组织化学染色分析证明本研究的可行性。 1 材料和方法 1.1 试验材料 本研究采用鄂马铃薯（Solanum tuberosum L.）3号品种（E3）的叶片、块茎和烟草的叶片，作为转化受体材料。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株为LBA4404，中间载体为pBI-121。 1.2 农杆菌的制备 取10 μL低温保存的菌液，接种于10 mL液体YEB（内含50 mg·L-1 Rif和50 mg·L-1 Kan）培养基中，于28 ℃、250 r·min-1培养20～24 h。再取1 mL菌液接入40 mL液体YEB培养基，于28 ℃、250 r·min-1培养大约6 h。 将40 mL菌液在4 ℃、5 000 r·min-1离心10 min，去上清得到菌体。加入40 mLMS液体培养基（内含200 μmol·L-1乙酰丁香酮）重新悬浮，将菌液OD600值调整至约0.8，室温（22 ℃）静置1 h后备用。 1.3 根癌农杆菌介导的瞬时表达 将马铃薯（E3）叶片和块茎用蒸馏水洗净后，用75%酒精漂洗，再用无菌水漂洗1次。烟草为无菌组培苗，其叶片无需清洗。 1.3.1 浸染法 用手术刀片在烟草叶片和马铃薯叶片划5～6处伤口，马铃薯块茎纵切成1～3 mm薄片，用蒸馏水洗净后放入菌悬液[LBA4404（pBI-121）]中，然后在真空泵中10 kPa抽滤20 min，取出后用无菌水冲洗1次[4]。将叶片放在铺有用无菌水浸湿的滤纸的培养皿里，于16 h光照、8 h黑暗、22 ℃培养2 d[5]；块茎只需暗培养2 d。 1.3.2 注射法 用1 mL无针头的注射器针管用压力将菌悬液[LBA4404（pBI-121）]注入完全展开的烟草和马铃薯叶片下表皮的2个叶脉之间[6]。对块茎也同样用1 mL注射器将菌悬液注入马铃薯块茎中[7]。将叶片放在铺有用无菌水浸湿滤纸的培养皿里，于16 h光照、8 h黑暗、22 ℃培养2 d；块茎只需暗培养2 d。 1.4 GUS组织化学染色 根癌农杆菌介导的试验材料培养完成后，进行GUS组织化学染色[8]。将叶片和薯片放入烧杯中，加入GUS染色液（20 mmol·L-1X-Gluc，0.2 mmol·L-1Na2HPO4，0.2 mmol·L-1NaH2PO4，0.1%TritonX-100，10 mmol·L-1K3Fe（CN）6，180 mmol·L-1EDTA）浸泡叶片和薯片，于37 ℃染色9 h后倒掉染色液，加入75%（V/V）工业酒精进行脱色。脱色完成后拍照，并且记录试验结果。 1.5 GUS活性定量检测 参照Jefferson[8]组织化学定位法进行。 2 结果与分析 2.1 GUS组织化学染色的形态表现 对用根癌农杆菌处理后的叶片和块茎进行GUS组织化学染色发现，无论是用浸染法还是注射法处理的叶片和薯片都有蓝斑的产生，肉眼识别的蓝斑又可以分为点状蓝斑和