四周高住低训对大鼠骨骼肌p70S6K影响.docVIP

四周高住低训对大鼠骨骼肌p70S6K影响摘 要: 目的:探讨低氧运动对大鼠骨骼肌蛋白量及p70??S6K?的影响。方法:SD大鼠分为四组: 常氧安静组、低氧安静组、常氧训练组、高住低训组。常氧安静组在常氧环境下安静生活; 低氧安静组在氧浓度13.6% 低氧舱内安静生活;常氧训练组和高住低训组进行4周的跑台 运动,每天训练1 h,每周训练6 d。高住低训组晚上在氧浓度13.6% 低氧舱内低氧暴露。 结果:28 d后,与对照组比较,高住低训组骨骼肌总蛋白浓度显著下降(?p? 1.1 实验对象 9周龄的雄性SD大鼠40只,由北京维通利华公司提供。昼夜节律人工控制光 照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,大鼠自由取食及饮水。 1.2 实验方法 适应性训练:40只SD大鼠在常氧条件下静养半周后,再进行半周的水平跑台递增负荷适 应性训练,淘汰不适应跑台训练的大鼠,然后筛选36只实验大鼠随机分为4个实验组。动物 分组及训练方式见表1。 表1 动物分组及训练方式情况 分组编号数量生活方式训练方式 常氧安静组NS 8常氧环境下安静生活无低氧安静组HS 8低氧环境下安静生活无常氧训练组NE 10 每天在常氧环境下以恒定 训练强度 :35 m/min强度训练1 h,其余时间在运动时间:1 h/d常氧环境下安静生活6 d/周,持续4周高住低训组HLE10每天在常氧环境下以恒定强训练强 度:35 m/min度训练1 h,19:00-7:00在13.6%运动时间:1 h/d,O?2低氧环境下安静生活6 d/周,持续4周 1.3 组织取材 四组大鼠均在第28 d取材,取材前禁饮食12 h,25%乌拉坦腹腔麻醉后,速取后肢趾长伸 肌,剔除肌腱及筋膜组织,用锡纸将其包裹后迅速投入液氮,而后置于-80℃冰箱保存待测 。 1.4 指标测试与方法 1.4.1 组织匀浆用于匀浆的肌肉样品,被切成重约100 mg大小,加50 μL的预冷的匀浆缓冲液于玻璃匀浆 器中冰上匀浆,当无肉眼可见的块状肌肉时,将匀浆液转移至1.5 mLEP 中,再用50 μL的 匀浆缓冲液冲洗匀浆器,也转移至EP管中。12 000 g,4 ℃离心10 min。取上清液,用于总 蛋白浓度测定及p70??S6K?测定。 1.4.2 骨骼肌总白浓度测定 骨骼肌总蛋白浓度采用Bradford 法测试,具体过程:1) 配制Bradford工作液:按照《精编分子生物学实验指南》??[2]?配制。2) 标准曲线制备:分别取1 mg/mL牛血清清蛋白(BSA标准蛋白)分别为0、10、20、40、6 0、80、100 μL,不足100 μL的再用生理盐水补足到100 μL,并将样品稀释数个梯度,以 测出最佳上样量。3) 加入5 mL Bradford工作液,用旋涡混匀器混匀,静置5 min。 4) 于595 nm处测定溶液吸光值A595 nm。制作标准曲线,并求出最佳上样量。5) 如上方法分批次测试样品吸光值,根据标准曲线求出样品浓度。 1.4.3 骨骼肌p70??S6K?及p70??S6K?(Thr389) 测定骨骼肌p70??S6K?蛋白表达和p70??S6K?(Thr389)磷酸化均采用Western Blot法测 定,所用试剂按照《精编分子生物学实验指南》??[4]?配制,具体过程如下: 1) 制胶:配制8%的分离胶灌入玻璃板中,用蒸馏水封胶,室温放置约30 min;再配制5% 的浓缩胶,胶凝固后取出梳子。 2) 取60 μg总蛋白,加入上样缓冲液、水、DTT,配成20 μL体系,混合均匀后置100℃沸 水中5 min,使蛋白变性,再于碎冰中冷却。 3) 上样:以3 000 rpm,室温离心。再将样品加入凝胶样品孔。 4) 电泳:5%的浓缩胶以80 V恒压,8%分离胶以120 V恒压条件下电泳。 5) 转膜:电泳结束后取出凝胶,放入转移缓冲液中浸泡10 min,再采用半干转将蛋白转 到硝酸纤维素膜(NC膜)上,以恒压20 V,持续90 min。 6) 封闭:将NC膜放入1×TBS液于摇床上轻摇5 min,再加入封闭液,室温下轻摇1.5 h 。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇漂洗。 7) 一抗孵育:将NC膜封入保鲜膜袋中,将用封闭液稀释过的一抗加入袋中,4℃孵育过 夜。不同抗体稀释比例分别为:actin 为1:1000,p70??S6K?抗体为1:1000,Phospho- p 70??S6K?(Thr389)为1:1200。之后将NC膜用TBST液洗3次,每次10 min,于摇床上轻摇 漂洗。 8) 二抗孵育:将N