95体细胞核移植法克隆动物.PPTVIP

第九章  细胞重组与动物克隆 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 细胞重组（cell reconstruction）：体外不同来源的细胞器及细胞组分重组成具有生物活性的细胞或细胞器的技术。 细胞拆合：分离细胞核与细胞质（或移去核、射线使核失活）将同种或异种细胞核和细胞质重新组成新细胞，从而培养新细胞或新生物个体。 细胞重组的三种基本方式： 胞质杂种（cybrid）：胞质体与完整细胞重组； 微细胞异核体（herterokaryon）：微细胞与完整细胞重组成微细胞异核体； 核质杂种细胞：胞质体与核体重组成核质杂种细胞。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 胞质体（cytoplast）：去核后的无核细胞。通过核移植技术制备。 微质体或亚原生质体（miniprotoplast or sub- protoplast） ：植物去核的原生质体。 微细胞（microcell）：具有一或几条染色体、一薄层细胞质和完整细胞质膜的核质体。制备：秋水仙素——产生多个有核膜的微核；细胞松弛素B——微核突出到细胞膜外；离心——微细胞（一个微核和一薄层细胞质以及完整细胞质膜）。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 细胞的生长过程包含细胞器的自我装配，但这是活体的自我装配。 细胞重组是离体的装配过程。细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供可能。 细胞重组结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物。 细胞器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要意义。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 细胞分离技术： 1.梯度沉降分离法 据细胞大小不同分离细胞。细胞在单位重力作用下，通过密度介质，或在低离心力的作用下通过梯度密度溶液沉降。 2.等密度沉降分离法 据细胞密度差异分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中，受强离心力的作用，最后达到与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。非连续密度梯度介质：细胞集中在介于自身密度的两种密度介质的交界面上。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 3.流式细胞仪分离法 以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞。将细胞悬浮液通过直径为50μm的喷嘴变成极小微粒，每个微粒含有一个细胞，以10m/s的速度喷出。激光照射，荧光被激发而转换成脉冲。依脉冲分离细胞。或施加电场使细胞移行偏斜的程度不同而收集不同的细胞。 优点：分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能； 缺点：需要专门的设备。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 细胞破碎方法： 1.超声波破碎法 超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击产生的剪切刀使细胞破碎。（缺点：热产生） 2.反复冻存法 细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内冷冻后，在37℃复融化，重复此操作3~4次使细胞壁破碎。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 3.化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸纳等使细胞膜裂解。常辅以机械方法。 4.高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 细胞重组常用的材料： 1.胞质体 细胞松弛素B：体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松弛素B的作用，结合高速离心得到胞质体。 2.核体 与胞质分离的得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，成为核体。 9.1.1 概述细胞重组与动物克隆 3.微细胞 秋水仙素处理。 经体外培养，在单个染色体或染色体周缘会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 9.2 鱼类两栖类的细胞核移植 在显微解剖镜下，将细胞置于消毒的培养液中，同时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以减慢细胞发育。借助显微操作仪，用细微玻璃针或微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中，可以挑去细胞核，人工造就去核细胞。 这种仪器能进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等。 9.2 鱼类两栖类的细胞核移植 （1934年成功进行了单细胞动物核移植操作。） 1938年（Hans Spemam）：提出“8细胞期以前的细胞核具发育的全能性”，构想实验：将胚胎细胞核移入去核的卵内。但因技术原因未完成。 1952年（Robert Brrigs 和T.J.King）：豹蛙囊胚细胞核移入去核卵内，获得可摄食的幼体。1955年，移入卵母细胞，获得蝌蚪，甚至成体蛙。