和口腔黏膜病相关假丝酵母菌代谢组学鉴定初步探究.doc

和口腔黏膜病相关假丝酵母菌代谢组学鉴定初步探究 　　[摘要] 目的 分析3种假丝酵母菌的磁共振代谢物图谱，探讨用代谢组学方法快速鉴定口腔黏膜致病菌的可行性。方法 在沙保培养基中分别接种白色假丝酵母菌ATCC 10231、热带假丝酵母菌ATCC 13803和光滑假丝酵母菌ATCC 15126，绘制生长曲线，选择3种菌生长稳定期的培养液检测其磁共振图谱，用主成分分析法进行数据分析。结果 主成分分析法显示：每两种细菌在主成分得分图中有组间分散、组内聚集的特点，可以区分不同的假丝酵母菌。结论 代谢组学分析技术是一种有良好发展前景的口腔细菌快速鉴定技术。 [关键词] 代谢组学； 磁共振； 假丝酵母菌； 主成分分析 [中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.018 白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌是正常人口腔、胃肠道、呼吸道及阴道黏膜的常见共生菌，仅能在特定条件下造成宿主感染。代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门对生物体或细胞的所有低相对分子质量代谢产物进行定量和定性分析的新技术。高分辨率磁共振（nuclear ma- gnetic resonance，NMR）可用于对细胞外微量代谢组分进行检测，得到相应的代谢图谱，使用先进的软件分析方法可以正确地归类处理这些图谱。本研究对与口腔黏膜病相关的3种假丝酵母菌的代谢图谱进行比较，用主成分分析法（principal components ana-lysis，PCA）进行分析，探讨用该方法寻找特征性产物来鉴定假丝酵母菌的可行性。 1 材料和方法 1.1 实验菌株及实验仪器 白色假丝酵母菌ATCC 10231、热带假丝酵母菌 ATCC 13803、光滑假丝酵母菌ATCC 15126（上海川翔生物科技有限公司）；CH-2生物显微镜（Olympus公司，日本），分光光度计（上海尤尼卡公司），高 速低温离心机（Jouan公司，法国），-80 ℃低温冰箱（Heto Ultra公司，美国），磁共振仪（Bruker公司，德国）；重水（上海楚柏实验室设备有限公司）；分析软 件SIMCA-P 11.0（Umea公司，瑞典）。 1.2 生长曲线的绘制 将白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌解冻，增菌48 h，经显微镜形态学检查及科玛嘉显色培养基鉴定为纯培养后，分别将3种假丝酵母菌接种于沙保培养基，培养48 h，用分光光度计调整菌悬液吸光度值为1.00±0.05备用。在9支试管中分别加入沙保培养液4.5 mL，在每支试管中加入白色假丝酵母菌菌悬液50 μL，同法将热带假丝酵母菌及光滑假丝酵母菌菌悬液50 μL分别加入9支试管中，各试管在37 ℃、200 r·min-1摇床行增菌培养，在3、6、9、12、24、36、48、60、72 h各取1支，旋涡振荡器混匀30 s，分光光度计测量菌悬液吸光度值，以纯沙保培养液作阴性调零，测定3种假丝酵母菌的菌悬液密度。将实验重复3次，取每个时间点的平均值，以时间（h）为横坐标，以OD600值为纵坐标绘制生长曲线。 1.3 测试样本的制备 分别取3种假丝酵母菌生长稳定期（培养36 h）的培养液于4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液1 mL，加0.5 mL磷酸盐缓冲液（2.4 g·L-1 KH2PO4， 8 g·L-1 Na2HPO4，7.2 g·L-1 NaCl），混匀后静置10 min，以相同条件（4 ℃、10 000 r·min-1）离心10 min，吸取上清液用0.22 μm滤纸过滤，取1.35 mL滤液，加入重水0.15 mL，混匀后将样品移入核磁管中（每管1.5 mL），置于-80 ℃低温冰箱保存，NMR测定前解冻并保持在0 ℃左右。 1.4 1H-NMR图谱的采集和处理 将核磁管放入磁共振仪中进行1H-NMR谱扫描，样本的扫描温度设置为295 K室温。采用磁共振仪专用参数，包括采集点数32×1 024，累加次数128次，每个样本扫描后均收集到131 072个数据点，波宽为7 788.162 11 Hz，每个样本扫描2～3 min，将得到的15个原始的自由感应衰减信号（free induction decay， FID）输入MestReC软件进行傅里叶转换（Fourier tran-sition，FT），并进行相位调整和基线调整，获得相位满意、基线平整的1H-NMR图谱。调用软件的积分工具，除去水峰所在区间，并对1H-NMR谱进行分段积分，其中每个FID信号有200个积分值。将每个样本的积分值导入Excel表中备用。 1.5 数据分析