分子生物学基因治疗.ppt

基因治疗Gene Therapy 一、概念 经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。 广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 2.基因治疗发展简史 1990年9月14日：第一例正式批准的基因治疗实验开始进行 （美国，世界上开展基因治疗最早的国家） 大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段： 体外试验和动物试验 I期临床试验——6---10名志愿者 II期临床试验——20---30名志愿者 III期临床试验——充分分析疗效、安全性 中国：1991年7月开始进行基因治疗试验 1、对导入的基因及其产物有详尽的了解 2、外来基因能有效地导入靶细胞 3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在 4、导入基因能有适度水平的表达 5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害 TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶， 胸苷激酶特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷， 后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因， 胞嘧啶脱氨酶在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。 5-氟尿嘧啶通过竞争性抑制胸苷酸合酶的活性，从而抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。 基因治疗途径 1、间接体内治疗途径（ex vivo) 是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但操作复杂） 2、直接体内治疗途径（in vivo） 将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等） 具有包膜，圆球状，直径为80~120nm 基因组是单正链RNA，3.5~9.0kb 病毒颗粒中有逆转录酶 能整合于宿主细胞的染色体 Lifecycle of retrovirus LTR(long-terminal repeat):长末端重复序列 Two fates of RNA: Translation:作为mRNA翻译成病毒的蛋白质 Packaging：作为病毒RNA基因组被装配成新的病毒颗粒 Packaging 2 RNAs in 1 virus （2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。 它通过受体介导的内吞作用进入细胞内， 腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。 其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。 AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。 这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性， 而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。 （1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。 这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。 多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。 这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。