god转基因酵母菌的构建及其重组god的纯化与活性分析.pdfVIP

ACADEMJCFORUM 摘要：葡萄糖氧化酶(GOD)被广泛应用于食品工业、医学诊断试剂等[1，3]。目前葡萄糖氧化酶生产主要采用的 发酵体系，大多数属于胞内表达存在生产成本偏高，且产出蛋白有杂质使产品纯度不够高等问题[2]。因此，如 何构建优良的GOD产生菌株，并让它有效的高表达，具有重要意义。本实验用SacI内切酶鉴定所保存的质粒是否 粒。用pPIC9K—H1S．一GOD用B]gII内切酶线性化，电转毕赤酵母菌GSll5，用PCR法鉴定其基因组中是否转化成功。 将得到的预期菌种做发酵表达，SDS—PAGE检测蛋白表达结果。 d 5；大肠杆菌DH5 关键词：GOD：SDS—PAGE：pPIC9K—H1s—GOD；毕赤酵母GSll 刘曼(兰州理工大学生命科学与工程学院) 1材料与方法 为100斗g／mL)的LB平板上，37℃倒置培养过夜，观察。 因为实验室前期构建的重组子已全部失活，没有存活体，所 3．3重组质粒pPIc9K—His—GoD的纯化 以本次试验中再次进行克隆。 取30“1用碱裂解法提取的转化后的大肠杆菌的粗质粒，加 Gsl15和Escherichia入等体积预冷的氯化锂，混匀室温离心1f)分钟，取上清。加入等 1材料pPIc9K—His—GoD、Pichiapastoris coIiDH5d 醇洗涤沉淀一次，流干乙醇但需是沉淀保持湿润状态，加入5斗1 2主要试剂和培养基 的RNaseA，静置30分钟。用标准的酚氯仿抽提重组质粒，将重 (1)LB培养基；(2)YPD培养基；(3)YPD一遗传霉素平板培养 匀，静置10分钟以上，室温最大转速离心20分钟，回收沉淀。用 基；(4)RDB培养基；(5)BMGY培养基；(6)FBs培养基；(6)1％ 琼脂糖凝胶； G一41 70％乙醇洗涤沉淀两次。40斗l无菌水溶解。 (7)1omg／mL 8溶液；(8)PEG—Mgcl2溶液； 3．4重组质粒pPrc9K—His—GoD的线性化 (9)100mmoI／LPMsF；(10)结合缓冲液pH=7．8；(11)洗脱缓冲液 选择B19Ⅱ内切酶线性化，建立40pl酶切体系，混匀反应液 pH=6．o；(12)6％sDs—PAGE凝胶；(13)酵母裂解液；(14)3mol／ LNaAc溶液。 3方法 外灯下观察线性化的结果。 3．1重组质粒pPIc9K—His—GoD的鉴定 分析重组子酶切位点，选择sacI内切酶鉴定重组质粒的正确 3斗l线性化的重组质粒加入到新鲜制备的40p1电感受态细 胞，轻轻混匀，转入预冷o．2cm电转杯中，冰浴5分钟。1979V， 性，建立10¨l的反应体系，37℃温浴3h，于1％的琼脂糖凝胶中 25 u 进行电泳，100v电泳约30min，紫外灯下观察，初步判断酶切产 物片段是否符合预期结果。 梨醇至该电转杯中，混匀再将其全部涂于YPD平板。30℃倒置培 3．2重组质粒pPIc9K—His—GoD的转化大肠杆菌 养3—6天，观察结果。 将1o斗l质粒转移至200斗l感受态细胞中，轻轻吸打均匀在冰 3．6转化酵母菌株的筛选 上静置