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三、DNA聚合酶 1、DNA聚合酶I：聚合酶活性：5’ ?3’，需要引物 外切酶：5’? 3’ 3’? 5’校正功能 应用：缺平移探针标记 DNA聚合酶I反应条件： 2、Klenow fragment： 聚合酶活性：5’ ?3’，需要引物 外切酶：3’? 5’ 用途： A：末端标记法 B：合成cDNA的第二链 C：随机引物（6nt）标记 D：末端终止法进行DNA序列分析 3、T4-DNA聚合酶 ： 聚合酶活性：5’ ?3’， 外切酶：3’? 5’ 外切酶活性较klenow片段的活性大200倍，对单链DNA的活性大于双链DNA。 特点：当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。 用途： A、填补或标记限制酶切割DNA后产生的凹缺3’ B、末端标记带3’突出末端的DNA： 利用3’ ?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端，再利用它的5’ ?3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP C、标记用作杂交探针的DNA片段 D、将双链DNA的末端转化成平 E：体外诱变 4、T7-DNA聚合酶: 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： （1）T7基因5编码的大亚基：有5’?3’聚合酶和3’ ? 5’外切酶活性。 （2）大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性 T7 DNA聚合酶的特点： （1）持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 （2）3’?5’外切酶活性高：单链和双链都能降解。 （3）不受DNA二级结构的影响：其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。 T7-DNA聚合酶的用途： A、用填补或交换（取代）反应快速进行末端标记； B、将双链DNA的末端转化成平末端； C、复制较长的模板进行引物延伸反应，在测序中读出较长的序列。 5、修饰的T7DNA聚合酶 通过修饰使3’?5’外切酶活性下降99%以上，但聚合能力不受影响，修饰后的T7DNA聚合酶在聚合反应中有很高的持续性；进一步改进的基因工程生产的测序酶2.0，完全没有核酸外切酶花性。 用途： （1）DNA序列分析，可读出较长的序列， （2）标记DNA 3’隐蔽末端和更有效地补平末端。 6、末端转移酶：罕见的DNA聚合酶：从小牛胸腺中纯化出的碱性蛋白质，催化单链或双链DNA分子的3’-OH末端添加一个至多个脱氧核苷酸的反应。 特点： （1）需要3’-OH和二甲胂酸缓冲液； （2）不需要模板！ （3）底物可以是单链DNA或是3’—OH突出的双链DNA，Co2+代替Mg2+下也可以作用于平末端。 （4）随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。 用途： （1）在载体或cDNA上加换互补的同源多聚尾，以便连接。 （2）标记DNA片段的3’末端 。 （3）快速扩增cDNA末端（Rapid??Amplification??of??cDNA??End简称为RACE）。 3、酶的使用： A、反应体积尽量保持最小（一般20-50?l），酶液的体积不超过反应总体积的10%，使甘油浓度小于5%，防止产生星活性； B、反应体系的成分中，酶最后加； C、取出使用应放在冰上，用完后立即放回冰箱，尽量避免反复冻融； D、多样品酶切时，先计算总量，取出酶稀释后再分别加至各管； F、每次取酶必须使用新的无菌吸头。 G、多种酶同时酶解时：可共用一种buffer时，则两种酶的酶切反应可同时进行；但如需不同的buffer时，则先低盐后高盐，如果对酶切效率影响不大，也可使用通用buffer；如果难以同时进行，一般采用一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 H、酶切反应的终止：一般65℃，15’后电泳，但是有些酶65℃不失活。如EcoRV，则要用酚氯仿抽提。 I、酶解后电泳分析体积过大时，可以用2.5倍体积冷乙醇，在液氮中放置15’，如低盐buffer，则还须补加3 mol/L NaAc至1/10体积；也可用0.6体积的5 mol/L 乙酸胺和2倍体积的乙醇，在冰上放置5分钟，然后于4℃、12000g，离心5分钟；或 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4，2.5倍体积的冰冷乙醇，冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、风干。 五.影响限制性核酸内切酶活性的因素 1、DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等将影响DNA样品的纯度。 如果DNA样品难以纯化时，可以采取下列方法进行酶切： 加大酶的用量，1 mg DNA 用