生物物理课件第一部分-2.pptVIP

如何解析蛋白质的空间结构？;研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。;（一）蛋白质的两性电离 ;当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点;（二）蛋白质的胶体性质 ;（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 ; 造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 ; 应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 ;变性蛋白质的性质改变： ① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。; 天然状态，有催化活性;* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 ;（四）蛋白质的紫外吸收;（五）蛋白质的呈色反应;二、蛋白质的分离和纯化;（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 ;* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 ;（三）电泳;电泳的类型;区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成几类： ① 滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)； ② 粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板； ;③ 凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高， ;双向电泳 (two-dimensional electrophoresis);记住这几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研???的重要技术。;（四）层析;蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 亲和层析(affinity chromatography)是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力（底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受体与底物等），建立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。;亲和层析;（五）超速离心 ultracentrifugation;蛋白质纯化方法总结：;一、蛋白质含量测定 ;1. 凯氏定氮法;2. 双缩脲法;3. Lowry法(Folin-酚法);Lowry法;4. 紫外吸收法 ;紫外吸收法的优缺点：;5. 考马斯亮蓝染色法;6. 胶体金测定法;7. 某一特定蛋白质的含量测定;二、蛋白质纯度的鉴定;（3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。 （4）溶解度分析： （5）N—末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。 ;（6）酶的纯度鉴定