甲基化检测2012-12-24.pptVIP

MLH1甲基化检测 MLH1甲基化测序摘要 CpG岛的概念、意义 PCR的原理及基本流程 MSP的原理、流程 BSQ/Methylight的技术简介 CpG dinucleotides and CpG-islands CpG-islands(ever) the length of genomic region≥200bp G+C ≥50% observed/expected CpG ≥ 60% CpG-islands(most recently-to exclude Alu) the length of genomic region≥500bp G+C ≥55% observed/expected CpG ≥ 65% CpG dinucleotide -CG…..CG- -GC…..GC- Wild-type generally(70%) methylation generally unmethylation Journal of Molecular Diagnostics(2009) Antonia R ,Sepulveda ,et al. CpG island —methylation CpG岛多位于基因启动子区域，当其发生甲基化时将改变染色质结构、抑制转录因子结合从而抑制基因的表达 后天表观遗传改变 CpG-islands— MLH1 methylation biallic methylated MLH1 loss of expression defetion of MMR CRC inition and progression unmethylated MLH1 MSI PCR PCR-即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链摸板互补的子链DNA过程。 反应成分：模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、Mg2+等。 PCR反应基本步骤： 1、变性：高温下，双链DNA解离成单链； 2、退火：低温下，引物与模版DNA互补区结合 3、延伸：中温下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的 DNA链延伸反应。 PCR—原理说明 PCR—原理说明 N cycles MSP 流程 DNA 提取 亚硫酸盐修饰* PCR* 琼脂糖凝胶电泳 亚硫酸盐修饰 PCR—引物设计 原理说明— PCR—MLH1引物（选出文献中3对） methylated-sense, 5’-acg tag acg ttt tat tag ggt cgc-3’; methylated-antisense, 5’-cct cat cgt aac tac ccg cg-3’. unmethylated-sense, 5’-ttt tga tgt aga tgt ttt att agg gtt gt-3’; unmethylated antisense,5’-acc acc tca tca taa cta ccc aca-3’. methylated-sense, 5-gat agc gat ttt taa cgc-3’; methylated-antisense, 5-tct ata aat tac taa atc tct tcg-3’. unmethylated-sense, 5-agagtggatagtgatttttaatgt-3’; unmethylated-antisense, 5-actctataaattactaaatctcttca-3’. Herman et al .(1998)-329 bp to -205 bp Parker et al. (2003) -248 bp to-178 bp Oncogene (2007) 26, 7596–7600 E Capel, R Hamelin et al. PCR—MLH1引物 Expression of hMLH1 is inactivated in the gastric adenomas with enhanced microsatellite instability PCR—MLH1引物比较 The Herman primer set not specific for a more proximal region of the promoter (A region)→may wrongly estimated the association between methylation of MLH1 and the lack of its protein expression The Paker/MJ primer sets spec