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第三章 蛋白质化学（II） ——蛋白质结构;第四节 蛋白质的分类;（2）依据蛋白质的组成分类;单纯蛋白质;结（缀）合蛋白质;蛋白质的各级结构;示 例;虾红素;木瓜蛋白酶;一、蛋白质的氨基酸组成;1、影响蛋白质三维结构的因素 内力（内因） 蛋白质分子内各原子间作用力 外力（外因） 与溶剂及其他溶质作用力 ;2、蛋白质分子内部的作用力;;1、肽键;①肽键中C-N键有部分 双键性质 ——不能自由旋转 ②组成肽键原子处于 同一平面（肽平面） ③键长及键角一定 ④大多数情况以反式 结构存在;共价主链 ; 2、二硫键 (Disulfide Bond) —S—S— 由含硫氨基酸形成 起稳定肽链空间结构的作用,二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界因素影响的稳定性越大。 二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失;3、酯键 (Ester Bond) Ser/Thr的羟基与AA的羧基形成酯键 磷酸与含羟基AA缩合形成磷酸酯键 维系某些蛋白质的结构，对其行使功能也是必不可少。;4、离子键 ( Electrostatic attraction );离子基团被与水分子的作用力屏蔽;5、配位键 (Metal-ion Coordination) 两个原子之间形成的共价键 共用电子对由其中一个原子提供 金属离子与蛋白质的结合方式 例如：铁氧还蛋白、固氮酶铁蛋白、细胞色素C含铁离子 胰岛素含锌离子 ;6、氢键( Hydrogen bond );7、范德华力 (van der Waals force ) ;8、疏水作用 ( Hydrophobic Interactions) ;三、蛋白质一级结构的测定;;1.样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量; 蛋白质测序策略; 蛋白质测序策略; 蛋白质测序策略; 蛋白质测序策略;; 蛋白质测序策略;; 蛋白质测序策略; 蛋白质测序策略; 蛋白质测序策略;两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 ;Sanger法 ;二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高，比DNFB法灵敏度高100倍 ;;—N=C=S + N—CH—COOH;肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 蛋白质N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 —水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。;肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质;末端分析;肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) ∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 ∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 ;2、二硫键的断裂;1、酸水解; 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 ;R1=Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制）;R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2=Pro（抑制） pH8-9;R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 ;R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2 ;肽链;酶的名称;2、化学裂解法 ①溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 ; ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 ;3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法 ;N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。;PITC;全自动氨基酸序列测定仪;2、氨肽酶法或羧肽酶法; 高电压;核糖体;6、肽段在多肽链中次序的决定;胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析