竹叶青蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子克隆和序列比较.pdfVIP

维普资讯 动 物 学 研 究 2003，Jtm．24 (3)：180—185 CN53—·1040／Q ISSN0254—-5853 ZoologicalResearch 竹叶青蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子克隆和序列比较 李文辉，高 荣，张 云 (中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223) 摘要：利用逆转录酶与聚合酶链反应相结合的RT—PCR法 ，扩增出5个竹叶青 (Trimeresurusstejnegeri)蛇 毒丝氨酸蛋白酶的cDNAs；将扩增的cDNA片段克隆入 pGEM—T载体中，筛选得到它们的基因，分别命名为 TSSP．1、TSSP一2、TSSP。3、TSSP一4和TSSP一5。经末端终止法测定核苷酸序列 ，推导出5个丝氨酸蛋白酶的全序 列；结合纯化的蛋白酶 N一末端序列测定结果，推导TSSP一2、一3和一4分别编码凝血酶样酶 stejnobin、纤溶酶 stejnefibrase1和2。5个丝氨酸蛋白酶分别含有 1～6个 N一型糖基结合位点，表明它们的计算分子量与纯化蛋 白表观分子量之间的差异是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在 60％一90％。TSSP一1和一2编码的成 熟蛋白酶由236个氨基酸残基组成 ，TSSP一3、一4和一5的则由234个氨基酸残基组成。TSSP一1编码的蛋白酶在组 成丝氨酸蛋白酶三联体催化活性中心产生了His41_Arg4的天然突变 ，这与其他 自然界已发现的丝氨酸蛋白酶明 显不 同。 关键词 ：蛇毒 ；丝氨酸蛋白酶；序列；底物专一性 中图分类号 ：Q959．62 文献标识码 ：A 文章编号 ：0254—5853(2003)03—0180—06 M olecularCloningandSequenceComparisonofSerine Proteasesfrom theVenom ofTrimeresurusstejnegeri LEEVVen—hui，GA0 Rong，ZHANG Yun (DepartmentofAnimalToxicology，KunmingInstituteofZoology，theChineseAcademyofSciences，Kunming，Yunnan 650223，China) Abstract：Reversetranscriptasepolymerasechainreaction (RT—PCR)wasemployedtoamplifycDNAsconstructed from Trimeresurusstejnegerivenomglandspoly (A) + RNAtofacilitatethecloningandsequencingofserineprotease genes．ThePCR productswerethensubclonedintopGEM—TvectorandtransformedintoE． colistrainJM 109．FiveSer_ ineproteasecDNAs(namedTSSP一1，一2，一3，一4and一5，respectively)wereclonedandsequenced．TheDroteaseencod— edbyTSSP一1ischaracterizedbya His4LArg4 mutation in the catalytictriad． Combined the resuItsofN。temr inalse- quencedetemr inationsofthepurifiedproteins，itisconcludedthatTSSP一2，一3and一4encodestejnobin (thrombin—like enzyme)，andstejnefibrase1and2 (fibrinol~icenzym