基因组重排筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（９）：１０５１１１ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 基因组重排筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株 １ １ ２ １ １ １ ２ １ 宋佳雯 　田　苏 　张玉如 　王志珍 　常忠义 　高红亮 　步国建 　金明飞 （１华东师范大学生命科学学院　上海　２００２４１　２泰兴市东圣食品科技有限公司　泰兴　２２５４１１） 摘要　谷氨酰胺转胺酶（ＴＧａｓｅ）的产量不足的问题一直限制其工业化生产规模，故采用基因组重 排的方法，筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株。通过对不同制备条件下原生质体纯度和形成率的考 量，获得制备原生质体的最优条件为以６ｍｇ／ｍｌ的溶菌酶浓度进行酶解，酶解时间２ｈ。再优化融 合条件，以２ｍｉｎ紫外灭活和４０ｍｉｎ热灭活结合的方法挑选出融合子。通过两轮基因组重排，经过 ９６孔板发酵高通量筛选和摇瓶发酵复筛验证，获得了一株产酶达７．１２Ｕ／ｍｌ的茂源链霉菌，相比 最初选用菌株的平均酶活提高６５．５％。发酵结果显示，酶活提高的原因可能是在重组后原酶成 熟更快、更彻底，且得到的菌株遗传稳定性良好。证明基因组重排能够有效提高菌株的产酶水 平，同时为谷氨酰胺转胺酶产量提高提供理论依据。 关键词　微生物谷氨酰胺转胺酶（ＴＧａｓｅ）　基因组重排　茂源链霉菌　高通量筛选 中图分类号　Ｑ８１９ 　　谷氨酰胺转胺酶（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＴＧａｓｅ，ＥＣ２．３． 被应用，并对谷氨酰胺转胺酶的产量有一定提升。但 ２．１３）是一种催化酰基转移反应的转移酶，能够将蛋白 是也存在一些问题，首先，物理诱变和化学诱变会杀死 质中谷氨酰胺残基的 酰胺基转移到伯胺基团、赖氨 细胞，诱导癌变对人体有一定危害［１０］。其次，诱变育种 γ 酸残基的 氨基或者水分子上，使蛋白质发生交联，改 为非定向性育种，一次需筛选上万菌株才能提高产 ε 变蛋白质的乳化性、溶解性、稳定性、弹性、凝胶强度、 ［６］ 量 。最后，由于诱变后只选择酶活最高的一个突变 ［１］ 黏性等性质 。 株，大量酶活提高的突变菌株的诱变突变得不到利用， ［２］ 非常浪费，多个诱变综合作用下酶活可能会有更大的 　　１９８９年，Ａｎｄｏ等 筛选到一株茂源链霉菌 ［１１］ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）并发现其能胞外分泌ＴＧａｓｅ。 提高 。 ［１２］ 由于微生物发酵产酶的原料便宜、生产周期短、纯化工 　　２００２年，Ｚｈａｎｇ等 的研究显示基因组重排育种 艺简捷、得率高，且得到的 ２＋ 相比随机诱变能够大幅提高筛选效率。通过建立突变 ＴＧａｓｅ无 Ｃａ 依赖性，目前 成为市场的主流。中国、日本、荷兰等国都对微生物发 子库，将突变菌株制备原生质体并融合，使基因发生重 酵产ＴＧａｓｅ的技术进行改善，但是目前的核心问题是菌 组从而提高酶活，再不断选择酶活提高的菌株作为下 株普遍产酶量较低，需要更加高产的菌株，因此对茂源 一轮的突变子库，减小发生负突变的可能性［１３］。这种 ［３］ 方法 目前 已经应用 于吸水链霉 菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 链霉菌高产菌株的选育非常重要 。