皱纹盘鲍一种丝氨酸蛋白酶抑制因子克隆与表达分析.pdfVIP

第30卷第1z期 水产 科 学 VoI．30NO．1Z 2011年1Z月 FISHERIESSCIENCE Dec．2011 皱纹盘鲍一种丝氨酸蛋白酶抑制因子克隆与表达分析 丁鉴锋1’2“，张国范1，李莉1 (1．中国科学院青岛海洋研究所，山东青岛266071；2。中国科学院研究生院， 北京100049；3．大连海洋大学，辽宁大连116023) 摘要：通过RACE方法获得皱纹盘鲍丝氨酸蛋白酶抑制因子的cDNA序列。该序列全长1446个碱 基。其中开放阅读框为410个碱基。该基因编码的氨基酸与丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin家族的结构 相近。另外，在基因启动子区发现一些与免疫和癌症发生有关的转录因子结合位点。采用qRT—PCR 方法分析该基因不同组织中表达情况，结果发现，在所有检测的组织包括外套膜、鳃、消化腺、血淋巴和 肌肉中均有表达。另外，使用鳗弧菌感染并检测鳃组织中该基因表达情况，结果发现，细菌刺激后该基 因表达量逐渐升高，表明丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在皱纹盘鲍抗菌反应中能够发挥免疫调节作用。 关键词：皱纹盘鲍；丝氨酸蛋白酶抑制因子；免疫 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1003-1111(2011)12—0731—08 皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)为鲍科贝类免疫级联反应激活中的潜在作用口。8]。一些贝类体 中最具经济价值的种类之一，在我国主要分布在北 内也发现丝氨酸蛋白酶及其抑制因子作为体液因 方沿海地区，是一种重要的海水养殖贝类，自20世 子的成分存在，如太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、 纪80年代初期开始大规模养殖。90年代初期爆发 东方牡蛎(C．virginica)、河蚌(Myaarenaria)及 了大规模死亡事件，几乎对鲍鱼养殖业造成了毁灭 蛤仔(Spisulasolidissima)等，并且其在贝类免疫 性的打击[1]。调查发现，种群遗传多样性下降和抗 中的调节作用已得到初步证实[9‘1引。但迄今为止， 逆性降低是国内鲍鱼病害爆发和蔓延的重要原因 还未见到在鲍鱼体内发现这类丝氨酸蛋白酶抑制 之一。对鲍鱼抗病、抗逆等性状相关基因的基础理 剂方面的报道。笔者利用分子生物学手段克隆得 论研究，将有望从根本上解决鲍鱼病害问题，具有 到皱纹盘鲍丝氨酸蛋白酶抑制因子基因cDNA全 重要的理论意义和实际应用价值。 长序列，并分析了该基因组织表达情况及细菌刺激 丝氨酸蛋白酶是一类重要的多功能的蛋白水 后的表达变化规律，为深入了解鲍鱼的抗病机制提 解酶，这些蛋白酶携其抑制因子，一同参与调整机 供重要理论依据。 体众多的生理和病理过程，包括消化、降解、受精、 1材料与方法 胚胎发育、血液凝结，纤维蛋白溶解，补体系统，炎 症和癌症，细胞免疫和体液免疫等[2-引。丝氨酸蛋 1．1 材料 白酶抑制剂是对丝氨酸蛋白酶有抑制活性的一类 试验用鲍鱼购自青岛南山水产品市场，平均壳 蛋白质，通过与蛋白酶相互结合形成稳定的复合 长(60士2)mm，平均体质量(27士3)g，随机分为2 体，来防止机体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活， 组，45头／组，装入70L的桶中，采用逐步升温法将 是生物体内免疫系统的重要组成部分。在无脊椎 饲养温度升至(20土1)℃，每日清洗养殖桶，更换海 d。 动物，丝氨酸