解毒化瘀药含药血清对白血病HL60ADR细胞Survivin基因表达影响的研究.docVIP

国家自然科学基金资助课题（项目批准号 贵州省高层次人才科研特助项目 解毒化瘀药含药血清对白血病HL60/ADR细胞Survivin基因表达影响的研究 马武开 李玉莹 黄礼明 姚宇红 姚血明 （贵阳中医学院第二附属医院，贵阳市飞山街83号：550003） 摘要 目的 探讨解毒化瘀药含药血清对白血病HL60/ADR细胞Survivin基因表达的影响。方法 应用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测解毒化瘀药含药血清处理后HL60/ADR细胞Survivin基因的表达，并与干扰素作对照。结果 解毒化瘀药含药血清能够降低HL60/ADR细胞Survivin基因的表达。结论 解毒化瘀药含药血清通过降低HL60/ADR细胞Survivin基因的表达，逆转白血病细胞耐药。 关键词：白血病；多药耐药；HL60/ADR细胞；Survivin；解毒化瘀药 白血病细胞的多药耐药是指白血病细胞同时对多种结构和不同作用机制的抗肿瘤药物产生耐受，即肿瘤细胞对细胞毒药物失去敏感性，限制了抗肿瘤药物的疗效，是白血病化疗失败和复发的主要原因。以传统中医理论为基础，从中医理论中寻找到具有耐药逆转作用的中药复方制剂是目前研究的热点。本研究用血清药理学方法和分子生物学方法研究解毒化瘀药含药血清对人白血病耐药细胞系HL60/ADR细胞的影响，探讨解毒化瘀药中药复方对HL60/ADR耐药细胞Survivin基因表达的作用。 1 材料与方法 1.1 中药水煎浓缩液的制备 解毒化瘀方（药物由青黛、山慈姑、蚤休、虎杖、莪术、川芎、丹参、补骨脂等组成）饮片置煎煮容器内，加相当于药材量5-8倍的冷水浸泡1-2小时，煮沸30分钟过滤，浓缩成每毫升含生药1g的药液，冷却后装入无菌药瓶，置4°C冰箱备用。 1.2 含药血清的制备[1] 新西兰大白兔10只（购自贵阳医学院动物所）灌服解毒化瘀方水煎液（按高剂量12g生药/kg体重灌服），每日1次，连续3天，于末次给药2h无菌条件下心脏取血，分离血清，组内血清混合，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，置-20°C保存备用。正常兔血清制备，灌药前1天取兔血，分离血清，方法同前。 1.3 主要试剂和仪器 主要试剂：RPMI 1640培养粉（美国GIBCO）、优质胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、MTT粉（北京天港邦定生物医学科技有限公司）、RNA提取试剂盒（天根生化）；RT-PCR试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）、琼脂糖（西班牙）；上样缓冲液（天根生化）；电泳缓冲液 (生物工程上海有限公司)。主要仪器：超净工作台（中国苏州），CO2培养箱（美国NAPCO），通用酶标仪（BIO-TEX美国），PCR梯度循环仪（美国）、流式细胞仪（美国Coulter Co. Ltd）、倒置显微镜（日本Olypmpus-LY70）。 1.4 细胞培养 将HL60细胞和HL60/ADR(购自中国医学科学院血液学研究所)接种于25ml培养瓶，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37°C、5%CO2条件下无菌培养，取对数生长期细胞，2-3天传代1次，更换细胞液。 1.5 MTT细胞毒试验[2] 将HL60及HL60/ADR细胞悬液1×106/mL加入96孔板中，每孔100μl，适应性的培养12小时后，实验组用各浓度含药血清培养(共10个浓度)，以不含药正常培养的HL60和HL60/AO2细胞为对照组，另外设调零孔，最终每孔为200μl。37℃，5％CO2孵育48小时，每孔加入5mg/ml的MTT磷酸缓冲液20μL，在同样条件下继续培养4小时，离心(1000r,5min)，弃上清，每孔加DMSO150ul，振荡10分钟，充分溶解结晶物，酶标仪检测，计算各组细胞毒性。根据回归方程求出半数抑制浓度（IC50）和耐药细胞的耐药倍数。计算方法：细胞生长抑制率=1-实验组OD值-调零孔OD值/对照组OD值-调零孔OD值）×100%。耐药倍数（细胞生长抑制率为50%药物浓度耐药倍数）=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。 1.6 流式细胞仪测定细胞内柔红霉素（DNR）的浓度 取处于对数生长期的HL60、HL60/A02细胞，PBS液洗涤3次，用10%小牛血清的RPMI1640培养液制成1×106/ml细胞悬液接种于培养板中，适应性培养6h后，分别加入低、中、高剂量中药血清200ul，西药对照组加入a-扰素(终浓度500U/ml)，空白对照组和兔血清组分别加入等量10%胎牛血清及等量兔血清，孵育15分钟后，分别加入浓度为10ug/ml的DNR，每孔终体积为2ml，置37℃，5%C02浓度培养箱培养90分钟，离心去上清，用PBS液洗涤2次，去除游离的DNR，用流式细胞仪(FC