最详细：CRISPR-Cas9系统原理应用及发展课件.ppt

3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰 2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的《efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。 3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰 3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰 * 中山大学生命科学学院 Like cruise missiles attacking military targets, these proteins, called transcription activator–like effectors (TALEs), can be programmed to home in on specific DNA sequences and carry out an action once there. Each TALE repeat targets a specifi c DNA base: A, T, C, or G. The repeats are the same series of 34 animo acids (color-coded) except at positions 12 and 13, which differ depending on the base being targeted. Once he had the code in hand, Bogdanove immediately wondered if TALEs could replace zinc fi ngers as the targeting mechanism for nucleases—creating so-called TALENs. * * CRISPR-Cas9系统基因修饰理论与实战 1 基因表达研究方法 干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一； 基因表达技术- 质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛运用，但同时其也存在缺点； 1 基因修饰的方法与各自优势 质粒- 瞬时转染 - 某些细胞效率偏低 - 表达结果不稳定，有内源表达的干扰； 质粒- 稳定细胞 - 表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组插入基因组中可能干扰其它基因表达； 病毒- 瞬时感染 - 表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达； 新一代的基因编辑技术- 利用重组酶在基因组水平修饰基因，产生的遗传性质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰，目前有成熟的技术如CRISPR/Cas9； DNA NHEJ and HDR DNA sequence disrupted NHEJ: Non-homologous end joining +donor DNA DNA sequence replaced HDR: homology directed repair DNA修复的机制与基因编辑原理 非同源性末端接合修复机制(Non-homologous end joining, NHEJ) 同源介导的修复机制(Homology-directed repair, HDR) * ZFN and TALEN ZFN与TALEN基因编辑原理 * I: Genome modification II: Genomic deletion Le C, F Ann R, David C, et al. 2013, Science, (6121):819-823. Genome Editing in Mammalian Cells * Dumpier nematodes Zebrafish embryos Fruit flies Pennisi E. 2013. Science, (6148):833-6. Rice Models generated by CRISPR/Cas9 system Monkey 1 CRISPR-Cas概述 1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。 2013以后，研究者们在包括《science》和《nature biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确