重组子筛选与鉴定.ppt

第六节 重组体的筛选与鉴定 DNA的体外重组 植物转化体报道基因筛选法 几种报道基因的作用原理 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 重组体的筛选与鉴定筛 pBR322抗菌素标记选择原理 pUC18/19 IPTG诱导的结果： 2、 根据插入基因的遗传表型筛选 DNA电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 二、分子检测法 PCR扩增检测 分子杂交检测 PCR扩增检测法 2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 （1）菌落印记原位杂交筛选 2. Northern blotting 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 第五节 免疫化学检测法 2. 放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert双位点检测法 二、免疫沉淀检测法 三、酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （2）一抗结合 （3）二抗结合 （4）显色反应 （5）比色 3.ELISA的局限性 临床检验常用的单抗 四、免疫印迹（western blotting）法 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 ④凝胶中的蛋白质染色： 直接染色电泳结果 （2）Western blotting Western装置 ② Blotting ③ Blotting过程 ④结果 第六节 转译筛选法 二、转译筛选 三、杂交抑制转译法 2. 过程 四、杂交释放转译法 2. 过程 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 ④胸苷酸激酶的补救作用 （2）TK选择过程 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） DHFR+细胞 DHFR- 细胞 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 （2）选择过程 3. 新霉素抗性基因（neor） ③ 新霉素抗性基因--neor （2）选择过程 4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT） （5） CAT分析方法 二、植物转化体报道基因筛选法 2. 几种报道基因的作用原理 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 核酸杂交检测方法 Southern blot 筛选结果 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G418培养基 真核细胞株均可。 neor基因。 ②宿主细胞 ③载体标记 G418：（100-800?g/mL） CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培养基。 真核细胞株均可。 cat基因。 乙酰氯霉素 （1）选择原理 （2） 选择条件 （3） 宿主细胞 （4）载体标记 chloramphenicol acetyl transferase 在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。 ② 免疫学检查： 用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。 Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. ① 分析乙酰氯霉素 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 1. 报道基因（reporter gene) （4）其它 4-甲-β-D-葡糖醛酸 荧光产物 GUS GFP 紫外光照 发绿色荧光 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸 蓝色水解产物 GUS 成熟 隐性 章鱼碱合成酶 成熟 隐性 胭脂碱合成酶 成熟 显性 庆大霉素乙酰基转移酶 成熟 显性 氯霉素乙酰基转移酶 成熟 显性 二氢叶酸还原酶 成熟 显性 潮霉素磷酸转移酶 成熟 显性 新霉素磷酸转移酶 方法是否成