实验十一玫瑰花环形成试验.docx

医学免疫学实验指导实验十一玫瑰花环形成试验由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。【实验目的】1.掌握淋巴细胞转换试验的原理和方法。2.熟悉淋巴细胞的形态特征。【实验目的】1.掌握淋巴细胞转换试验的原理和方法。2.熟悉淋巴细胞的形态特征。【实验原理】人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体，在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合，可以形成以T细胞为中心，周围黏附着多个绵羊红细胞的花环，为E花环试验（erythrocyte rosette test）。应用最广的有总E花环试验（Et,t为total的缩写）和活性E花环试验（Ea,a为active 的缩写）。 Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数，Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数，这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究，为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。【实验材料】1.1%肝素水溶液。2.Hanks液(无Ca2+、Mg2+)PH7.4-7.6。 3.淋巴细胞分离液（市售商品）。 4.绵羊红细胞悬液：取新鲜绵羊血以1:1的比例与爱氏血球保存液混合，置4℃备用，2周内使用。 5.0.8% 戊二醛、姬姆萨染液。 6.离心机、水浴箱，显微镜等。 【实验方法】1.无菌抽取患者静脉血1毫升，加入事先有0.05毫升肝素液的试管内,混匀抗凝。 2.加Hanks液1毫升于上述试管稀释血液，然后缓慢加入盛有1毫升淋巴细胞分离液的试管中，注意不要打乱交界液面。 3.2000 转/分钟水平离心20分钟。 4.小心吸取血浆层和分离液层之间的白色膜状的淋巴细胞层，Hanks液洗涤两次，最后用含20%小牛血清的Hanks液将细胞调成2×106/毫升。 5.将爱氏液保存的绵羊红细胞用 Hanks液洗涤三次，弃上清，将压积红细胞用 Hanks 液配成 1% 细胞悬液（ 8×10 7 / 毫升）。 6.Et 试验：将淋巴细胞悬液 0.1 毫升和绵羊红细胞 0.1 毫升混匀（细胞数合适比例为 1 :100 ），37 ℃ 水浴 10 分钟，低速离心 500 转 / 分钟，5 分钟，再置 4 ℃ 2小时或过夜。取出后弃去大部分上清，轻轻摇匀，加0.8% 戊二醛 2 滴固定数分钟后涂片，自然干燥后加 1 滴姬姆萨染液，覆以盖玻片，高倍镜观察。凡淋巴细胞周围吸附 3 个或以上绵羊红细胞者为阳性花结细胞。 7.Ea试验:将淋巴细胞悬液0.1毫升和绵羊红细胞0.02毫升混匀（两者比例为1:20）,低速离心500转/分钟，5分钟,弃去大部分上清，轻轻摇匀，加0.8%戊二醛 2滴固定数分钟后涂片，其余程序同Et试验。【实验结果】 随机计数 200 个淋巴细胞，记录其中形成花结的和未形成花结的淋巴细胞数，然后根据下列公式计算E花结形成百分率：E花结形成百分率 = 形成花结细胞数/（花结细胞数+未形成花结细胞数）×100%，一般正常值Et为50-70%，Ea正常值为 25—35%。 【注意事项】1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且绵羊红细胞受体会从T细胞表面脱落。 2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散开消失。 思考题： 3.E 花环形成的原理是什么？为什么测 Ea比Et更有意义？