Western Blot 实验过程.doc

Western Blot 实验过程 样品处理 　　由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。 　　注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。 培养的细胞（定性）： 1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2. 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 3. 100℃，1min。 4. 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 5. 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 6. 待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞（定量）： 1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2. 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3. 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4. 12000g离心，4℃，2min。 5. 取少量上清进行定量。 6. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 组织： 1. 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 2. 12000g离心，4℃，2min。 3. 取少量上清进行定量。 4. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 电泳 1. 上样前将胶板下的气泡赶走。 2. 所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。 3. 以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。 4. 在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。 转膜 1. 电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备： 　　湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。 　　浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。 2. 取胶： 　　将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路） 3. 转膜： 　　湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。 　　干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。 封闭及杂交 　　封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。 1. 封闭： 　　将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 2. 结合一抗： 　　一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。 　　反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。 3. 洗涤：