上皮细胞培养1表皮细胞培养取材-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.8.8.23 细胞生物基本方法：上皮细胞培养 1）表皮细胞培养 1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮 肤更好，切成0.5～1 平方厘米小块。 2 ．EDTA 处理：先置入0.02 ％EDTA 中室温置5 分钟。 3 ．冷消化：换入0.25 ％胰蛋白酶中，置4 ℃过夜。 4 ．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。 5 ．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25 ％胰蛋 白酶中，37℃再消化30～60 分钟。 6 ．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。 7 ．培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle 液和20 ％小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2 温箱培养。 2 ） 乳腺组织培养 直接培养法：（适于培养含纤维少的软组织） 1．在含有少量培养液或Hanks 液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。 2 ．把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻， 置试管架3～5 分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2～3 次。 3 ．末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。 不待细胞团块下降立即通过3～4 层无菌纱布滤入另管中。 4 ．调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。 胶原酶消化法：（适于处理含纤维多的较硬组织） 其过程与培养其它组织相同。 3 ） 胃上皮细胞培养 1．取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。 2 ．清洗：用含庆大霉素 （400 微克/毫升）和二性霉素 （2 微克/毫升的Hanks ） 液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3 大小。 中国试剂网 3.8.8.23 3 ．消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80 分钟。 4 ．离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次。 5 ．接种：末次离心后加入含有1％～2 ％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔 数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。 4 ） 肝细胞培养 初代组织块培养： 取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右 的小块，采用帖壁培养法。 初代消化法培养： 1．把肝组织切成2～4 立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS 液洗两次。 2 ．移入1：1 的0.1 ％胰蛋白酶和0.1 ％胶原酶 （都用无钙镁BSS 配置）中，4 ℃ 冷消化10～12 小时后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。 3 ．收集细胞、BSS 液洗1～2 次、计数、接种培养。 消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法；肝脏灌流需用全肝，以较小动物如小鼠 和大鼠为好。 1．无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污。 2 ．取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结 扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入肝管系统，并不时轻揉压肝脏，以 便消化液进入肝小叶中；消化液在肝内停留20～30 分后，在吸出消化液的同时 并轻揉压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。 3 ．待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640 培养基培养 （较其它培养基为好），能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。 传代培养： 待细胞生长连接成片后，用BSS 洗一二次，加1：1 的0.025 ％胰蛋白酶和0.02 ％ EDTA 混合消化3～5 分钟，待细胞回缩，便停止消化，弃掉消化液，用BSS 洗一二次，注入营养液，吹打，制成细胞悬液，再接种培养。 中国试剂网