动物生物化学试验.PPTVIP

动 物 生 物 化 学 实 验 实验六 凝胶层析法基本练习 一、实验目的 1. 学习凝胶层析法分离混合物的基本原理 2. 掌握凝胶层析法的基本操作 二、 实验原理 1. 凝胶层析基本原理： 凝胶层析是以各种多孔凝胶为固定相利用混合物中各组分的分子大小不同而进行分离的技术。 固定相： 各种多孔凝胶，填充于层析柱中 流动相： 洗脱剂，缓冲液或蒸馏水 示意图如下： 2. 凝胶层析法常用凝胶： 主要有葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶。 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是以葡聚糖(葡萄糖通过α-1,6糖苷键结合而成的线性高分子)为单体，以1,2—环氧氯丙烷为交联剂，聚合而成的具多孔网状结构的高分子化合物。商品名为Sephadex。其网孔的大小可通过调节交联剂和葡聚糖的比例来控制，交联度越大，网孔越小，交联度越小，网孔越大。 其结构如下图： 3. 本实验原理 本实验是凝胶层析法的基本练习。分离的混和物为碱性硫酸铜和血红蛋白。由于其分子大小的差异，通过凝胶柱时，大分子的血红蛋白先流下，硫酸铜后流下，由此将其分开。 三、 实验试剂及器材 1. 样品液：血红蛋白液-碱性硫酸铜溶液按1：1混和 2.葡聚糖凝胶：Sephadex G-25 3. 洗脱液：蒸馏水 4. 器材：层析柱，洗脱瓶等 四、实验操作 1. 凝胶溶胀 称取一定量的凝胶，浸泡于与洗脱液相同的溶液中（蒸馏水），过夜，令其充分溶胀。或煮沸溶胀2小时。 2. 装柱 安装好层析柱。 将已经溶胀的凝胶，边搅拌边加入层析柱中，尽量一次加完。 装柱时应注意凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。柱装好后，不管使用与否，都应有液体(与洗脱液相同)浸过凝胶表面，以免混入空气。 3. 平衡 装好的凝胶柱，使用前用洗脱液流过柱子一段时间，使凝胶压实。 5. 洗脱 打开洗脱瓶出口开关，使洗脱液流经凝胶柱，在柱下出口处用螺旋夹控制流速为1ml/min，随着洗脱液的流下，可见红、蓝两部分逐步分开，并流出。 6. 收集 待红色部分接近柱底部时，开始用试管收集。每管收集2ml，至全部颜色部分都流出，收集液为无色透明液体时，停止收集。分别合并红色和蓝色部分的液体，即为已经分开的血红蛋白和硫酸铜。 五、实验结果及分析 以凝胶层析法的基本原理说明实验中的现象及结果 * * 根据交联度的不同，商品葡聚糖凝胶从G-10至G-200共有8种型号(见下表)。G后面的数字是其吸水量（毫升/克干胶）乘以10而得的值，代表其孔径大小。交联度大，孔径小，吸水少，交联度小，孔径大，吸水多。 4. 加样： 打开层析柱下口开关，放出凝胶柱面上的溶液至弯月面刚好在胶面，关闭下口开关。 用刻度吸管吸取0.5ml样品液，缓慢加入样品于胶面上，然后打开下口开关，使样品液慢慢渗入凝胶内。 待样品液面与胶面刚好相平时，关闭下口，然后先用吸管在柱面上加一层洗脱液，约3-5厘米高，接上洗脱瓶，准备洗脱。