在基因导入受体时.PPTVIP

第十三章基因工程 1.教学目的和要求 （1）掌握基因工程的基本原理 （2）学习基因工程的基本内容和技术 （3）掌握内切酶、连接酶的功能 2.教学重点 （1）掌握基因工程的基本原理和技术 （2）学习目的DNA的分离 第十三章基因工程（Gene Engineering） 在各种酶的作用下，将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接，形成重组的DNA分子，以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞，并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。 要点： 供体、载体、受体 基因工程分狭义（上游）：重组、克隆、表达的设计和构建。 广义（下游）：表达工程菌的发酵培养和产物的纯化。 目的：DNA扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。 基因工程 限制性内切酶和载体是基因工程的众多理论与技术基础中最重要的基石。 基因工程的基本步骤可概括为： 目的基因的获得(基因克隆)； 目的基因与载体连接(DNA分子重组)； 重组DNA分子导入受体； 转化子的筛选、鉴定。 限制性内切酶与DNA连接酶 细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用： 特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)； I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列； II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。 来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接成重组DNA分子。 通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。 重组DNA技术是基因工程最核心的技术。 载体(vector) 用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。 在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体； 在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。 常用基因工程载体有： 细菌质粒(克隆)； λ噬菌体(克隆)； 柯斯质粒(克隆)； 穿梭质粒(克隆/表达)； 细菌人工染色体(克隆/表达)； 酵母人工染色体(克隆/表达)； Ti质粒及其衍生载体(转化)。 (一)、目的基因的获得 基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。 1. 基因库构建与目的基因分离； 2. PCR扩增、克隆基因； 3. 基因合成(化学法、酶促法)。 获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、表达机制以及表达机制研究。 克隆的含义 名词(pl. clones)：克隆、无性(繁殖)系。 生物个体、细胞的无性繁殖系； 同一基因或DNA片段的多份拷贝。 动词(cloning)：克隆。 细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞； 分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有①将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利用宿主细胞DNA复制系统进行复制；②利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR, 聚合酶链式反应)。 基因库构建与目的基因分离 基因库(基因文库)：包含特定基因组所有基因、DNA区段的全部分子克隆的集合体。 根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库和线粒体库等。 构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因克隆(亚克隆)的方法。 (二)、转基因受体 受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、受体的再生等都有很大的影响。 植物基因工程常用受体：组织、器官、悬浮培养细胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官发生、胚状体或直接发育形成转基因植株。 动物基因工程受体主要有两类：一是受精卵或早期胚胎，发育形成转基因动物。转基因动物获得的性状可以稳定的遗传，表明外源基因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是体细胞无性系。 (三)、目的基因导入受体 将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是基因工程目标实现的关键环节。 在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化，将接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称为转化体/转化子。 最常用转化方法是： 载体导入； 理化方法导入(微注射、基因枪、电穿孔法、化学法)； 还有一种特殊的方法是将外源总DNA导入植物。 1. 载体法导入外源基因 载体法——将目的基因连接到特定的载体(转化载体)上，利用载体进入细胞并整合到受体染色体上的能力实现外源基因转化。 Ti质粒及其衍生载体是最常用的植物基因工程转化载体，具有导入外源基因并整合到染色体上的能力。 将目的基因与载体连接的过程就是重组DNA分子构建的过程。 将含有转化载体(重组DNA分子)的根癌农杆菌与受体共培养就可以实现转化。 2. 理化方法导入外源基因 理化方法是采用物理、化学方法使受体细胞