大鲵细菌性感染综合症病原分离和药敏试验研究.docVIP

大鲵细菌性感染综合症病原分离和药敏试验研究 　　摘　要　对细菌性感染综合症病鲵的体表、肝脏、肾脏、肠道、四肢、腹水等进行细菌分离培养与纯化，共得到12株细菌．经细菌的形态结构、生理生化特性鉴定和人工感染试验证实，布拉克枸橼酸杆菌（Citrobacter　braakii），嗜水气单胞菌（Aeromonas　hydrophila）和洛菲不动杆菌（Acinetobacter　lwoffi）为主要致病菌．药敏试验结果表明，3种病原菌对很多抗生素均存在不同程度的耐药性，而对美洛培南（Meropenem）高度敏感，　其可作为防治该病的首选药物． 关键词　大鲵；细菌性感染综合症；生化鉴定；药敏试验 中图分类号　S943 文献标识码　A 文章编号2012 大鲵（Andrias　davideanus），也称娃娃鱼，是我国特有的珍稀有尾两栖动物，　国家二级保护动物，其经济价值高，具有广泛开发利用的前景［1］．为恢复和有效利用大鲵资源，自20世纪60年代起国内有许多单位开始对大鲵进行人工养殖研究，并取得了较好的效果．但近年来随着养殖规模不断扩大，养殖大鲵经常发生各种疾病，给广大养殖户造成惨重的经济损失．2010年10月份，贵州松桃龙洞原生态科技发展有限公司大鲵养殖场发生了细菌性感染综合症，该病国内虽有报道［2］，并分离鉴定病原菌为嗜水气单胞菌，但病原种类和症状等多样的原因尚有争议.发病症状主要表现为患病大鲵头部红肿溃烂，腹部肿胀积有大量腹水，肝脏肿大，体表黏液部分脱落，体表和四肢有绿豆大小的白斑，随着病情的发展，白色斑点进一步腐烂成溃疡状直至暴露红色的肌肉．患病大鲵四肢无力，食欲减退直至死亡．养殖者在铒料中添加庆大霉素（Gentamicin）进行试治，效果不显著．笔者就此进行相关研究，分离到3种致病菌，现报道如下． 1　材料与方法 1.1　试验材料 1.1.1　材料　患病大鲵来自贵州松桃龙洞原生态科技发展有限公司大鲵养殖场，体重70～100　g；牛蛙来自长沙市马王堆水产市场，健康正常，体重100～150　g，在水族箱内驯养一周． 湖南师范大学自然科学学报 第35卷第6期 于　?等：大鲵细菌性感染综合症的病原分离与药敏试验分析1.1.2　培养基　营养琼脂培养基：牛肉膏　3.0　g，蛋白胨　10.0　g，NaCl　5.0　g，琼脂　15.0　g，加水补充到1　000　mL，pH　7.0． 1.2　方法 1.2.1　病原菌分离　从贵州松桃龙洞原生态科技发展有限公司大鲵养殖场采集体长14～22　cm，体重70～100　g的濒死大鲵4尾，解剖，用接种环在体表、肝脏、肾脏、肠道、四肢、腹水等病灶部位挑取少量组织液，分别在普通营养琼脂平板上划线接种，　于28　℃恒温培养24　h，　选取单个菌落接种于斜面，　再进行平板划线，　将分离到的细菌提纯培养，保存至斜面备用． 1.2.2　分离菌的菌落形态观察及染色　对培养出的细菌菌落进行观察，并对其大小、形态、颜色、隆起度等特征进行记录．对分离纯化的上述培养菌进行革兰氏染色，观察细菌的个体形态及染色特征． 1.2.3　分离菌的生理生化特性检查及菌种鉴定　取分离纯化的上述培养菌，　分别进行氧化酶、葡萄糖发酵等试验，鉴定其生物学特征，同时进行接触酶、七叶苷、吲哚、糖（　醇及苷）类代谢等较系统的理化特性测定，具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》［3］和《伯杰细菌鉴定手册》　［4］． 1.2.4　人工感染牛蛙试验　将分离菌18　h培养物制成菌悬液，菌浓度稀释为2.0×109/mL，　然后分别对100　g左右健康的牛蛙进行腹腔注射感染，每尾注射剂量为0.5　mL．以注射等量无菌生理盐水的健康牛蛙作为对照，根据菌种数量分为若干组，　另设多株菌混合感染组，其中每菌种菌液用量相等．各组注射试验牛蛙各10尾．连续14　d观察并记录试验牛蛙的病症及死亡数目，　计算其死亡率．同时对人工感染发病濒死的牛蛙进行病原菌再分离，　检查所分离的菌株与原分离菌株在形态与理化特性等方面是否一致． 1.2.5　药物敏感试验　按常规药敏纸片法测定抗生素对分离菌株的抗菌谱，　以涂布法接种分离菌株，　然后将药敏纸片贴在培养基上，　28　℃培养18～24　h　后，　测定抑菌圈直径，参照NCCLS判断标准［5］进行敏感性判定．检测的抗生素包括呋喃妥因、阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、左氟沙星、美洛培南、美洛西林、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、复方新诺明、头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林、强力霉素、磷霉素等21种，药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司． 2　结果 2.1　菌株分离结