杆状病毒表达系统介导的猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究.ppt.ppt

试验流程 人工合成PCV2 ORF2基因 BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 PFastBac Dual载体 连接 pFastBacDual- Pph-ORF2质粒 KpnⅠ和XhoⅠ双酶切 KpnⅠ和XhoⅠ双酶切 ORF2基因 连接 pFastBac Dual-2ORF2 转化DH10Bac大肠杆菌 蓝白斑筛选 Bacmid-2ORF2 脂质体转染法转染Sf9细胞 Ac-2ORF2 1、构建pFastBacDual-Pph-ORF2 a、人工优化并合成PCV2 ORF2基因，并在上游引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，下游引入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点，全长732bp b、用BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切ORF2基因和PFastBacDual载体，将酶切片段回收并连接，得到pFastBacDual-Pph-ORF2质粒，ORF2基因插在Pph启动子之下 用KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，经鉴定正确 HindⅢ识别位点是：AAGCTT KpnⅠ识别位点： GGTAC↓C 人工合成的PCV2 ORF2基因 XhoⅠ BamHⅠ KpnⅠ EcoRⅠ 1.5.1 提取重组Bacmid DNA (1)挑取含重组阳性Bacmid菌落，37℃培养，过夜 (2)12000rpm离心2min，收集细菌 (3)0.3mL溶液Ⅰ重悬细菌 (4)加入0.3mL溶液Ⅱ，轻